전단 응력 변화에 따른 미생물 점착 특성 연구

장영미, 최호석, 강용

충남대학교 공과대학 화학공학과

A study on the adhesion characteristics of microorganisms with respect to the change of shear stress

Youn-Mi Jang,  Ho-Suk Choi,  Yong Kang

Department of Chemical Engineering, Chungnam National University

Taejon, 305-764, Korea

서론

고체 기질로 미생물의 점착 현상을 이해하는 것은 생물공학기술의 응용에서 매우 중요하다. 고체담체에 미생물 고정화 메카니즘은 미생물과 담체사이에서 부분 공유결합과 정전기적 상호작용으로 설명할 수 있다.(1) 특히 마이크론 크기의 입자와 표면사이의 상호작용은 생물공학뿐만 아니라 여러 다른 산업 분야의 기술 개발에 중요하다. 이러한 기술은 기존의 효소 고정화 기술에 비해 경제적인 면에서나 생물 반응계의 안정성 측면에서도 우월하기 때문에 광범위하게 적용되는데, 산업적 적용의 구체적 예로는 세척업, 종이 제조, 물의 정제, 가스 정제, 부양, 섬유 제조업 등이 있다.  또한 입자와 담체 표면간의 상호작용은 생물학적 시스템에 많이 적용되며 이러한 예들로는 cell의 접촉, cell의 점착과 부착(2), cell의 분리, 치아 표면에 박테리아의 점착(dental 카리에스 형성의 원인), 식균작용(phagocytosis: 하나의 cell에 의해 입자의 섭취), surface-induced thrombosis와 심장혈관의 이식에서 색전증 방해, 열 교환기와 냉각 탑에서 발생되는 생물학적인 오염현상과 생물학적인 부식현상의 방지를 들 수 있다. 게다가 미생물과 고체 표면사이의 상호 작용은 해양 오염과 관련하여 그 중요성이 부각되고 있고, 그 문제점이 현실화되고 있다. 이상에서 언급된 분야에서 점착(adhesive) 현상의 광범위한 적용에도 불구하고 아직 이에 대한 정량적인 이론의 개발 및 체계적 연구가 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 화상분석계(image analysis system)를 사용하여 미생물 고정화 과정을 관찰하고, 그 과정에서 형성된 생물막의 구조를 분석하여 그 형성 메카니즘을 파악하고자 한다.

실험

평판 flow cell과 화상 분석 시스템은 Sjollema 등에 의해 처음 고안되었다.(3),(4) 그림 1은 평판 flow cell과 현미경(Olympus BX), video camera, computer 등으로 구성된 화상 분석기와 flow cell system의 개념이다.(6) 작동원리는 시스템이 작동하는 동안 미생물의 부유물은 폐쇄된 flow cell을 통과하고, 그 부유물들은 실리콘 관을 통해 정량 펌프에 의해서 다시 반응기 속으로 공급됨으로써 재 순환된다. 화상은 flow cell의 하단 유리판에 부착되는 미생물들의 흡착과정 등을 현미경을 통해 외부 computer 모니터로 관찰할 수 있다. 실제로 flow cell의 상단과 하단을 구성하고 있는 유리담체는 유리린스 염화나트륨 용액으로 깨끗이 하였으며, 증류수로 세척한 후 다시 메탄올로 세척하여 최종적으로 물로 세척하였다. 또한 하단 판에 투명한 유리판을 장착할 수 있도록 홈(1.8×1.8×0.03mm)을 내어 투과에 의해 유리에 부착되는 미생물을 관찰하도록 제작되었다. Flow cell은 두 평판 사이에서 충분히 발달된 층류를 얻기 위해서, 유로의 두께와 폭을 0.6mm와 38mm로 하였으며 channel의 길이는 230mm로 하였다. 딱딱한 판을 이용하여 일정한 channel의 깊이를 유지하며, 시스템이 작동하는 동안 평행을 유지하도록 하였고, channel을 통해 유입되는 유량을 일정하게 하기 위해 정량펌프를 이용하였다. 미생물의 관찰은 long warking distance (Olympus-LMLAPO 100×BD(F.N.26.5))를 지닌 대물렌즈를 이용하여 관찰하였다.

결과 및 토론

1. 화상분석

담체 표면에 흡착된 각각의 미생물들은 화상 분석 시스템을 이용하여 분석하였으며 이미지는 flow cell을 통과하여 glass 표면에 부착된 미생물들을 캡쳐 하였다. 미생물은 자동측정 파라미터를 이용하여 미생물의 수와 직경, 좌표, 면적 등을 분석하였으며, 여기서 흡착된 물체의 좌표 파라미터는 pixel에서의 기하학적인 중심으로 측정하였다. 직경은 원형비율의 평균값으로 측정하였으며, 미생물의 면적은 평균적으로 각각 0.75□, 1.236□2의 값을 얻었다.

2. 시간에 따른 미생물의 축적량

그림 2,3은 시간에 따른 미생물의 단위 면적당 흡착된 미생물의 수를 화상분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다. 초기 시간에는 미생물의 활성이 다소 부진하여 단위 면적당 평판 plate에 축적되는 미생물의 수가 적었지만, 시간이 경과한 후 미생물의 성장이 활발히 진행됨에 따라 단위 면적당 평판 plate에 축적량은  거의 일정하게 증가하는 것을 볼 수 있다.

3. 부착효율

부착효율 [eqn: { alpha }_{ e}]는 0에서 1사이의 값을 갖는데, 전단응력에 영향을 받으며, [eqn: { epsilon }_{sp }]의 함수이다.(5) 층류흐름 하에서 미생물의 순수 축적속도는 전단응력이 증가함에 따라 감소하는데 이는 전단응력이 증가함에 따른 탈착율의 증가로 설명할 수 있다. 유량 0.373(□/min)에서 평균유속 [eqn: { upsilon }_{b }]는 2.74×10-4m/s이다.

[eqn: { r}`_{a,CFU } ^{'' } = { { X}_{bC } {D }_{X } } over {h } LEFT [ { { LEFT ({ 2} over {9 { K}_{1 } } RIGHT ) }^{1/3 } } over { GAMMA LEFT ( 3/4 RIGHT ) + { 1} over { { epsilon }_{sp } } { LEFT ({ 2} over {9 { K}_{1 } } RIGHT ) }^{1/3 } } RIGHT ]]            (1)

여기에서, [eqn: { r}`_{a,CFU } ^{'' }]= substratum으로 CFU의 흡착속도(CFU/L2t)

XbC = bulk liquid에서 CFU 농도(CFU/L3)

DX = cell이나 CFU의 diffusivity(L2/t)

h = channel의 1/2두께(L)

K1 = channel 입구로부터 무차원 길이(-), [eqn: { K}_{1 } } = { 1} over {Pe } LEFT ( { 8L} over {3h } RIGHT )]

h = channel의 1/2두께(L)

L = 입구로부터 길이(L)

Pe = Peclet number(-), [eqn: Pe = { 4 { nu }_{b } h} over { { D}_{X } }]

[eqn: { epsilon }_{sp }] = substratum-paticle capture factor(-)

□ = gamma function[□(4/3) = 0.89338]

식 1을 이용하여 [eqn: { epsilon }_{sp }]를 계산하면 [eqn: { epsilon }_{sp }] = 44.153이고, 그 값을 식 2에 대입하면 부착효율, [eqn: { alpha }_{ e}] = 0.868이다.

Fig. 1 Schematic diagram of the image analyzer and flow cell system

5min          15min         35min         55min

75min          95min         115min        130min

Fig. 2 Digitized images of microorganisms attached on a glass surface in a flow cell from a flowing suspension at a flow rate of 0.373□/min.

Fig. 3 Number of adsorbed cells on glass substratum at area(54.93□×41.61□)

참고문헌

1. Dr. Frieda and B. Kolot, "Microbial Carriers Strategy For Selection", Process Biochemistry, Aug/Sept, 2(1981).

2. A.K. Camper, M.A. Hamilton, K.R. Johnson, P. Stoodley, G.J. Harkin and D.S. Daly, "Bacterial Colonization of Surfaces in Flowing System: Methods and Analysis", Center for Biofilming Eng., Montana State University, Ultrapure Water, Sept,(1994).

3. J. Sjollema, H.J. Busscher and A.H. Weerkamp, "Real-time Enumeration of Adhering Microorgani는 in a Parallel Plate Flow Cell Using Automated Image Analysis", Journal of Microbiological Methods, 9, 73(1989).

4. R. Bos, H.C. van der Mei, J.M. Meinders, H. J. Busscher, "A Quantitative Method to Study Co-adhesion of Microorgani는 in a Parallel Plate Flow Chamber: Basic Principles of the Analysis", Journal of Microbiological Methods, 20, 289(1994).

5. W.G. Characklis, K.C. Marshall, "Biofilms", John wiley & sons, Inc., New York, 1990.