누에체액에 의한 포유동물 세포의 Apoptosis 억제

최신식, 박태현↕

서울대학교 응용화학부

Inhibition of Mammalian Cell Apoptosis by Silkworm Hemolymph

Shin Sik Choi, Tai Hyun Park↕

School of Chemical Engineering, Seoul National University

서론

프로그램된 세포 죽음, 즉 apoptosis는 정상적인 조직 발생을 조절하며 암, 바이러스 감염, 자가면역증후군 그리고 퇴행성 질환과 같은 인간의 임상적인 장애를 제어한다. 백시니아 바이러스를 비롯한 보통의 바이러스들은 숙주 세포의 면역반응과 염증반응에 간섭하는 여러 세포 성분들과 상호작용을 일으키는 각종 유전자들이 암호화 되어있다. 세포 내 바이러스 감염은 세포 손상과 세포막의 보존을 상실시키는 necrotic 변화를 가져와 결국은 세포 죽음에 이르게 된다. 또 한편으로는, 바이러스에 감염된 세포의 죽음이 감염 후의 apoptotic response 때문일 수도 있다. 백시니아 바이러스를 포함하는 poxvirus의 숙주 범위 유전자에 대한 연구에서 그 유전자들 일부가 apoptosis 억제와 상관관계가 있다고 하나 아직 poxvirus 감염에서 apoptosis의 역할은 잘 알려져 있지 않다. 누에체액은 재조합 단백질을 얻기 위한 동물세포 배양에 필수적인 첨가물인 고가의 FBS를 대체하기 위해서 곤충세포 배양의 연구에서 사용되었다[1, 2]. 이 후에 baculovirus-곤충세포 시스템에서 누에체액이 apoptosis를 억제시킨다는 사실이 밝혀졌다[3, 4]. 본 논문에서는 누에체액이 백시니아 바이러스가 HeLa에서 일으키는 apoptosis를 억제시키는지 연구하였다.

실험

Cells, virus, and reagents. HeLa 세포는 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium, Gibco)에 10% fetal bovine serum을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 유지하였다. Vaccinia virus(vSC8)는 Escherichia coli의 □-galactosidase 유전자가 삽입된 재조합 바이러스로 동국대 박정극 교수님으로부터 분양 받았다.

Silkworm hemolymph. 누에의 생활환에서 애벌레의 마지막 시기인 5령 3-4일째의 누에의 다리를 잘라내어 채혈하였으며, 60℃에서 30분간 열처리 후, 0.2 □막 여과기에 여과시킨 것을 실험에 사용하였다.

Electrophoretic DNA fragmentation assay. 감염시킨 HeLa 세포를 표시된 post infection time에 harvest한다. Lysis buffer (20mM Tris-HCl, pH 8.0, 10mM EDTA, pH 8.0, and 0.5% Triton X-100)로 suspension시키고 10분 동안 ice incubation한다. 12,000rpm에서 10분 centrifuge하여 상등액을 취하여 같은 부피의 phenol/chloroform으로 4℃에서 1시간 동안 extraction시킨다. centrifugation으로 fractionation한 후 ammonium acetate를 넣고 ethanol precipitation시킨다. -20℃에서 overnight하고 이 DNA를 37℃, 1시간 동안 Rnase A와 반응시킨다. 0.1□g/ml의 ethidium bromide를 함유한 1.5% agarose gel에 loading한다.

TUNEL assay. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) 방법을 위해 TUNEL Label 과 TUNEL Enzyme을 Boehringer Mannheim. Germany.로부터 구입하였다. Cell fixation, permeabilization 그리고 labeling을 manufacture's standard method에 따라 모두 수행되었다. TUNEL assay에 의해 label된 세포는 형광 현미경으로 분석하였다.

결과 및 토론

바이러스에 감염된 세포는 감염 후 12시간까지는 세포 모양이나 viability의 변화가 거의 없다. 감염 후 24시간이 되면 세포의 rounding이 일어나고 floating하는 세포들이 생기면서 viability도 떨어지게 된다. Fig. 1.에서 10% FBS가 첨가된 배지에서 자란 세포는 감염 후 24시간부터 세포의 rounding과 floating이 일어나

Fig. 1. Effect of silkworm hemolymph on host cell longevity. The host cell viability was defined by the ratio of viable cells determined by trypan blue exclusion test to total cells. ●, 10% FBS; ○, 5% FBS and 5% silkworm hemolymph.

면서 viability가 떨어지기 시작하였으나, 5% FBS와 5% 누에체액이 첨가된 배지에서 자란 세포는 감염 후 24시간까지 세포의 rounding이나 floating이 잘 관찰되지 않았고, 36시간까지 90% 이상의 viability가 유지되었다. 이는 누에체액의 어떤 성분이 감염된 세포의 roundig이나 floating하는 속도를 늦추었고, 수명을 12-24시간 연장시키는데 작용을 한 것이다.

Apoptosis를 겪는 세포는 DNA를 nucleosome 단위로 자르는 endonuclease를 활성화시켜 DNA fragment가 생성되고 이것은 apoptosis의 biochemical hallmark가 된다. Cell viability가 직접적으로 apoptosis를 설명해 주지는 못하기에 electrophoretic DNA fragmentation assay를 통하여 누에체액의 효과를 관찰하였다. Fig. 2.에서 보면 10% FBS 세포는 감염 후 36시간부터 DNA fragmentation이 일어나 시간이 지날수록 그 정도가 심한 데 반해, 5% FBS와 5% 누에체액 세포는 감염 후 36시간에서 DNA fragmentation이 나타나지 않았고 48시간부터 나타났으며, 잘려진 정도 또한 전자에 비해 매우 작았다. 누에체액의 apoptosis 억제 성분이 세포 내 endonuclease의 활성을 지연시켰으며 그 크기도 많이 낮추었다.

Fig. 2. Silkworm hemolymph blocks DNA fragmentation produced in HeLa cells after infection with vaccinia virus. HeLa cells were inected with vaccinia virus at a M.O.I. of 5 PFU per cell and cells were harvested at the indicated time. Total cellular DNA was isolated and separated on a 1.5% agarose gel.

Electrophoretic DNA fragmentation assay 방법은 세포 각각의 상태를 말해주지는 못하는 한계를 가지고 있기 때문에, TUNEL assay를 통하여 각 세포별로 일어난 apoptosis를 확인하고 아울러 DNA strand가 잘려진 세포의 수를 형광현미경을 통하여 비교 관찰하였다. (Fig. 3.) 감염 후 48시간에서 10% FBS 세포들이 5% 누에체액 첨가 세포들에 비해 2내지 3배 많은 수가 형광을 나타냈다.

누에체액이 apoptosis를 억제하는 mechanism을 생각해 보면, 우선 누에체액에 의한 바이러스의 세포 내 침입 방해를 생각할 수 있다. 백시니아 바이러스와 CHO (chinese hamster ovary) 세포 시스템에서 바이러스의 침입 과정이 apoptosis를 trigger한다는 보고가 있었다[5]. 따라서 바이러스 감염 후 바이러스 용액의 titer를 plaque assay에 의해 조사했고, 그 결과 양쪽 바이러스의 95%가 binding하였다. 백시니아 바이러스의 one-step growth curve (data not shown)를 보면, 결국 두 환경에서 바이러스의 침입 차이는 없다. 누에체액이 바이러스가 가지고 있는 antiapoptotic gene의 expression을 증가시켰다는 가능성도 있다. 그러나 이러한 gene의 overexpression은 바이러스의 성장에 영향을 미쳐, 누에체액이 첨가된 배지에서 자란 세포에 감염된 바이러스의 성장이 10% FBS 세포의 것보다 현저하게 증가할 소지가 큰데, 바이러스 성장에는 누에체액이 영향을 주지 않았다. 물론 host restriction과 apoptosis는 숙주 세포와 바이러스에 따라 다른 경로를 가질 수도 있으므로 앞으로 더 연구가 필요하겠다.

누에체액은 산업적으로 동물세포를 배양하는 곳에서 세포의 죽음을 줄여 고효율을 이룩할 수 있고, 누에체액의 성분이 분리되면, 최근 의학계의 핫 이슈인 apoptosis와 관련된 여러 가지 질병에서 누에체액의 apoptosis 관련 성분이 중요한 역할을 담당할 것이다.

Fig. 3. Inhibition effect of silkworm hemolymph on DNA strand breaks. Cells were cultivated in the 10% FBS (a) or in the 5% FBS and 5% silkworm hemolymph (b) medium. The cells were labeled on the 48 hour after infection with fluorescein-dUTP by using exogenous terminal deoxynucleotidyl- transferase (TdT) (magnification, ×100).

감사의 글

본 연구는 Brain Korea 21 사업에 의해 교육부로부터 지원 받았으며 이에 감사드립니다.

참고문헌

1. Lee, S. H., and Park, T. H., Biotechnol. Tech., 9, 719(1995).

2. Ha, S. H., and Park, T. H., Biotechnol. Lett., 19, 1087(1997).

3. Rhee, W. J., Kim, E. J., and Park, T. H., Biotechnol. Prog., 15 (1999).

4. Rhee, W. J., and Park, T. H., Biochem. Biophy. Res. Comm., 271 (2000).

5. Ramsey-Ewing, A., and Moss, B., Virology, 242 (1998).