고순도 Conjugated Linoleic Acid 의 분리정제를 통한

Tri-CLA 합성에 관한 연구

한유리, 홍준기, 이성권, 최청송

서강대학교 화학공학과

A study on Structuring Lipids of High Purity Tri-CLA

via Separation and Purification of Conjugated Linoleic Acid

Yuri Han, Jun-Kee Hong, Seong-Kweon Lee, Cheong-Song Choi

Department of Chemical Engineering, Sogang University

서론

1978년부터 미국 위스콘신대학교의 Michael W. Pariza 교수 연구팀은 육류중의 단백질과 같은 유기물질 등이 가공 중의 열변성에 의하여 유전독성을 일으키는 물질을 생성되리라는 가정 하에 살모넬라 변이균주를 이용한 돌연변이 시험법(mutagenicity test using Salmonella typhimurim)을 이용하여 시험하였다. 이 과정에서 쇠고기 육류의 열추출물(fried ground beef) 중에는 항돌연변이 작용을 갖는 물질이 있을 것이라고 생각하게 되었다. 대부분의 단백질 유래의 성분은 열변성과정을 거쳐서 돌연변이 유발물질로 변화하는 것에 비하여 쇠고기 육류(grilled ground beef : 햄버거 등)의 열변성 과정을 거친 분획 중에는 항돌연변이 성분이 있으며, 그것을 공역화 리놀레인산(CLA라 명명함)이라는 것이 밝혀졌다. 이러한 CLA의 발견은 동물성 식품(특히 소고기 및 유가공품)의 생산과 수출을 전략으로 하는 미국 및 전세계의 학자들에게 흥분이 아닐 수 없었다. 그 당시 대부분의 동물성 식품은 각종 성인병과 암 발생의 주요 원인 인자로 생각되는 점을 감안하면 획기적인 발견이었다.

최근 진행되고 있는 triglyceride의 제조방법에 대한 연구는 원료로부터 분자증류 또는 초임계 유체 추출법에 의한 분리 또는 효소를 이용한 합성 및 분리가 많이 진행되고 있다. 그러나 초임계 유체 추출법과 분자증류법은 고순도 분리에 있어 기술적인 어려움이 있으며 많은 장치비가 요구되는 불리한 조건을 지니고 있으며 또한, 효소를 이용한 방법은 고가의 효소가 필요할 뿐만 아니라 긴 반응 시간이 요구되는 등 대량생산을 통한 산업화에 있어 경제성이 결여되는 치명적인 단점을 가지고 있다. 따라서 본 연구에서는 triglyceride 합성 후 존재하는 불순물들을 분리정제하기 위해 활성화된 고체요소를 이용하여 지방산 메틸에스터 성분을 제거하고 diglyceride와 소량의 monoglyceride를 Solid-Liquid Chromatography를 통해 제거함으로써 고순도 triglyceride을 정제하였다.

고순도 CLA 의 분리정제

보통 CLA는 불포화지방산인 리놀레인산이 함유된 홍화씨기름이나 해바라기씨기름을 수산화칼륨과 반응시켜 CLA성분을 만든다. 이 과정에서 CLA의 순도를 보다 높이기 위해 선행되어야 할 것은 리놀레인산의 고순도 분리정제이다. 본 연구에서는 고순도의 리놀레인산을 분리해 내기 위해 리놀레인 산의 지방산 전환과 두차례의 요소포접을 수행하였으며 이를 통해 99%의 리놀레인산을 분리할 수 있었다. 요소포접을 이용하여 지방산을 분리하는 방법은 요소수용액이나 요소-알코올 용액과 지방산의 혼합용액을 냉각하여 요소가 결정화되면서 지방산을 포접하는 요소포접방법과 활성화된 고체요소에 헥산-지방산 용액을 섞어 지방산이 요소 표면에 흡착되도록 하는 방법을 이용하였다.[1] 리놀레인산의 분리시에는 전자의 방법을 TG 합성후 정제에는 후자의 방법을 이용하였다.

CLA합성에는 에칠렌글리콜(ethylene glycol)과 수산화 칼륨(KOH)

그리고 리놀레인산이 이용된다. 온도는 180℃로 유지하도록 하며 먼저 1L의 에칠렌글리콜을 넣고 hot plate에서 가열한다 어느정도 가열하면 250g의 수산화 칼륨을 넣고 녹인 후, 리놀레인산 500ml를 넣는다. 반응이 끝나면 메탄올과 염산을 넣어가며 pH를 4에 맞춘다. 그 후 헥산과 물로 추출시키며 헥산은 증발기에서 날려준다.

CLA의 메칠 에스터화

Tri-CLA의 합성을 위해 먼저 수행되어야 할 것은 고순도로 제조된 CLA의 에스터화(esterification)가 필요하다. 일반적인 지방산의 에스터화 반응은 다음과 같다.

~~~~COOH + CH3OH  →  ~~~~COOCH3 + H2O

↑

H2SO4, Na2SO4

그림 1. 지방산의 메칠 에스터화

황산에 의해 이온화된 지방산과 에탄올이 결합함으로써 ester가 생성된다. 이때 물이 존재할 경우 emulsion이 형성되어 반응에 방해가 되므로 본 연구에서는 무수황산나트륨을 첨가해줌으로써 에스터화 반응 중 필연적으로 형성되는 물을 제거할 수 있었다.

Tri-CLA 합성과 분석

TG 합성반응이 원활하게 이루어지도록 잘 건조된 알칼리금속 탄산염을 촉매로 사용한다. 본 연구에서는 촉매로서 탄산나트륨(Na2CO3, solium carbonate)을 사용하였다. 탄산나트륨은 글리세롤에는 녹지만 TG에는 녹지 않으므로 반응이 끝난 후 여과함으로써 간단히 제거할 수 있다.[3] 글리세롤에 탄산나트륨을 넣고 150℃에서 가열하여 녹인다. 다 녹으면 글리세롤과 에스터의 몰비가 0.14:1로 제조된 에스터를 3-4차례에 걸쳐 분할 주입한다. 반응시간은 9시간정도이며 감압하에서 수행한다. 이때 감압처리는 글리세롤의 -OH기와 에스터의 -CH3기가 반응해서 생긴 메탄올을 제거하기 위함이다. 본 연구에서 주목했던 점은 우선, 글리세롤로부터 MG, DG의 형성을 유도한 후 TG를 형성시키는 것이다.이를 위해 분할 주입한 ester로부터 먼저 반응을 유도한 후 차츰 TG를 형성시켜 나간다. 또한 반응시 물이 존재하지 않도록 잘 건조된 원료와 촉매를 사용하였다.

합성된 제품은 Gas Chromatography와 TLC (Thin layer Chromatography)를 이용하여 분석하였으며 결과는 그림 2와 같다. TLC 전개액은 헥산, 에텔 에테르, 메탄올, 아세트산을 85 : 15 : 3 : 2 의 비율로 혼합한 혼합액을 사용하였고 발색제는 Molybdenum blue(Sigma)를 4.2M H2SO4 와 1 : 1 로 혼합하여 사용하였다. TLC Plate 는 silica를 입힌 plate(Sigma)를 사용하였다. 그림 2의 (a)에 나타낸 바와 같이 합성된 제품에는 TG, DG, MG 및 미반응된 지방산, ester 가 존재한다.

TG의 분리정제

합성이 완료된 용액에는 미반응된 CLA와 CLA 메틸에스터, MG, DG, 색소 및 불순물이 포함되어 있다. 따라서 고순도의 TG를 얻기위해서는 요소포접에 의한 분리와 Solid-Liquid Chromatography(SLC)에 의한 분리가 요구된다. 요소포접화합물에 의한 분리는 요소결정의 표면을 활성화하여 미반응된 CLA 와 ester, MG 등의 직쇄상 유기물질을 결정표면에 흡착되도록 하여 분리하는 것이다. 이때 고체요소의 활성화 정도에 따라 분리능력이 달라진다. 요소에 포접된 물질의 분석결과는 그림 2의 (b) 와 같다. 이와 같이 미반응된 CLA와 ester, MG를 제거한 후 Tri-CLA만을 정제하기 위하여 silica gel을 이용한 SLC를 수행하였다. TG, DG, MG 과산화물 및 색소등은 silica column 내에서 그들의 극성(polarity)차이에 의해 분리될 수 있다.헥산 용매하에서는 Tri-CLA이 제일 먼저 회수되고, DG, MG, 과산화물 및 색소 순으로 회수된다. 따라서 TLC 분석에 의해 하나의 spot이 될 때까지 elution된 것을 회수하면 곧바로 Tri-CLA가 되는 것이다. 여기서 TG와 DG, MG등은 용출되는 차이가 많이 나므로 쉽게 분리가 가능하다. 그림 2의 (c)는 99%의 TG를 나타낸다.

결과 및 고찰

본 연구의 결과는 다음과 같다.

Tri-CLA의 조성은 Diglyriceride(0.36%); Triglyceride(99.64%) 이었다.

참고문헌

1. C.S.Choi., "Effect of Oleic Acid on the Separation of □-Linolenic Acid from Seed Oil of Oenothera Lamarkiana", The 4th Korea-Japan Symp. on  Separation Tech.,(1996).

2. Haagsma, N., Van Gent, C. M., de Jong, R. W. and van Doorn, E., JAOCS, 99, 117 (1982).

3. Eberhard Peukert, H., Horst Rutzen, L., Gerhard Wollmann, H.: U.S. Patent 5,254,722 (1985).

4. Andr□ C. Bach., Yves Ingenbleek., and Anny Frey., Journal of Lipid Research, 37, 708 (1996).

에스터

TG

지방산

DG

MG

과산화물 및 색소

(a)	(b)	(c)

그림 2. TG 합성 과정

그림 3. 99% Tri-CLA 의 GC gram