High-Performance Membrane Chromatography에 의한

Oligonucleotides의 분리

홍 승 범·김 정 일·선 향*·노 경 호

인하대학교, 화학공학과

*기술표준원

Separation of Oligonucleotides

by High-Performance Membrane Chromatography

Seung Bum Hong, Jung Il Kim, Hyang Sun*, Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University, Inchon 402-751, Korea

*Agency for Technology and Standards. MOCIE

서론

High-performance membrane chromatography(HPMC)는 최근 들어 많은 연구가 진행되고 있는 크로마토그래피의 기술 중에 하나이다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 현재 가장 효율적인 HPMC 분리 기술에서는 미세공 조직을 가진 박층(thin layer)의 사용과 두께 2-3mm 원형의 Convective Interaction Media(CIM)를 고정상(stationary phase)으로 사용하고 있다[1]. 이러한 기하학 구조의 고정상에서 membrane adsorption (MA)에 의해 분자들의 분리가 일어난다. 기존의 High-Pressure Liquid Chromato- graphy(HPLC)에서는 컬럼에 충전된 흡착제와 이동상간의 확산, 입자사이의 흡착과 탈착의 메커니즘으로 분리가 되는데 비해서 HPMC에서는 흡착제의 작용과는 구별되는 얇은 막을 통해서 쉽게 전달이 되는 것을 이용한다. HPMC는 membrane과 컬럼 크로마토그래피를 결합한 형태의 분리기술 이다. HPMC의 장점은 빠른 분리속도, 낮은 압력강하, 높은 선택도, scale-up이 쉽고, 조작이 간단하며 pH에 무관하게 안정적으로 조업할 수 있다. HPMC의 응용 분야로는 peptides, proteins, oligonucleotides와 polynucleotides 분자들의 정제와 분리, solid-phase extraction, biosensors 등에 대한 분야이다[2, 3]. Nucleotides는 DNA단위를 구성하고 있는 nucleoside의 인산에스테르 이다. Oligonucleotide는 nucleotide를 구조단위로 하는 2∼20정도의 중합체중에서 분자량이 5,000∼10,000인 oligonu- cleotides를 본 실험에서 사용하였다[4].

본 연구의 목적은 oligonucleotides를 분리하기 위해서 다양한 분석방법인 RP-HPLC, MECC(Micellar Electrokinetic Capillary Chromato- graphy) 및 HPMC를 사용하여 각기 분리 방법에 따른 분리도를 고찰하는 것이다.

원리

HPMC의 원리는 확산이동성의 차이와 불 균일한 표면 작용에너지(sur- face interaction energy)로 인한 것이다. HPLC에서는 컬럼에 충전된 다공성 입자들 사이의 다공 확산과 흡착에 의해서 분리가 되지만 HPMC에서는 막을 통한 분자 확산운동과 세공의 크기에 의한 메카니즘에 의해 분리가 일어난다. 따라서 짧은 시간동안에 분리를 할 수 있으며 낮은 압력과 유량 조절이 가능하다. 다공성 분자들이 접촉 가능한 이론적인 수(theoretical number)는 다음과 같은 식으로 계산된다.

d2 = 2DtD

d는 분자가 이동하는 액상에서 다공성 벽까지의 거리, D는 자유확산 계수, tD는 자유 확산에 의해서 다공성 벽까지 도달하는 시간이다. tres는 분리층 안에서 분자의 체류시간이고

tres = L/U

L은 분리층의 길이, U는 유량이다. 위의 두 식으로 부터 일정한 시간 범위내의 다공성 표면과 접촉하는 분자들의 이론단수를 구할 수 있다.

N = tres/tD = 2DL/Ud2

최근에는 단백질 분리에서 최대의 선택도를 얻기 위해서 고정상의 물리적인 길이와 유사한 X0(working part)라는 새로운 변수를 도입하였다[1].

X0 = □UCC/(ZB)

U는 고정상을 통한 이동상의 유속, CC는 용질이 탈착되는 곳에서의 임계농도, Z는 용질의 전하를 이동상 이온의 전하로 나눈 유효 전하, B는 선형 구배의 기울기, □는 0.5값을 갖는 보조 상수이다.

(a) CIM- Disks Monolithic Columns      (b) CIM- Tubes Monolithic Column

Fig. 1 Types of CIM (Convection Interaction Media)

실험

1. 시약 및 기기

본 실험에 사용된 oligonucleotides는 National Institute of Chemistry에서 구입하였고 oligodeoxynucleotide 8(oligo 8), C CAT GTC T3'; oligodeoxynucleotide 10(oligo 10), GTC CAT GTC T3'; oligo- deoxynucleotide 12(oligo 12), AC GTC CAT GTC T3'; oligo- deoxynucleotide 14(oligo 14), C GAG GTC CAT GTC T3'를 사용하였다. 고정상으로는 직경이 12mm, 두께가 3mm인 Monlithic Convective Interaction Media(CIM) disk 사용하였고, HPLC는 Waters사의 600E 펌프(multisolvent delivery system), 490 UV-visible tunable wavelength absorbance, 254nm, U6K 주입기(2□ sample loop), Rheodyne 주입기(2□ sample loop), 데이터 저장 시스템은 Chromate(ver. 3.0, Interface Eng.)를 사용하였다.

2. 방법

본 실험에서는 CIM DEAE(diethylaminoethyl) disk를 고정상으로 하고 이동상은 buffer A(20mM Tris-HCI, pH 8.5)와 buffer B(1M sodium chloride in 20mM Tris-HCl, pH 8.5)를 사용하였다. RP-HPLC에서는 MeOH, KH2PO4, MgCl2를 용매로 사용하여 구배용매 조성법으로 분리하였고 직경이 250 mm×4.6mm인 Alltech 컬럼을 사용하였다. MECC에서는 0.01M Na2HPO4, 0.006M Na2B4O7을 사용하였다.

결과 및 고찰

Fig. 2에서는 oligonucleotides보다 분자량이 작은 modified nucleicacid, mononucleotides를 MECC로 분리한 결과 우수한 분리도를 보여 주고 있다. 이 보다 분자량이 큰 oligonucleotides를 RP-HPLC를 이용하여 분리하였다. (Fig. 3) 그러나 분자량이 매우 커지게 되면 MECC와 RP-HPLC를 이용하여 분리하기가 매우 어렵다. 그러므로 HPMC를 이용하여 oligo- nucleotides의 분자량에 따라서 일정용매 조성법(a)과 구배용매 조성법(b)을 이용하여 분리하였다. (Fig. 4)

알림

본 연구는 인하대학교 고순도 분리연구실에서 수행하였습니다.

참고문헌

1. Tennikova, T.B, Anal.Chem, 71, 2986(1999).

2. Tennikova, T.B, Belnkii, B.G, Svec, G, J. Liq.Chromatogr. 13,63

(1990).

3. Frenx, J, Horvath, Cs. In High-Performance Liquid Chromatography;

Advances and Perpectives: New York, 5,211(1988).

4. Row, K. H, Korean J. of Chem. Eng., 6, 4(1989).

Fig. 3 Nucleic base sequence- selective separation using RP- HPLC

(1 ml/min flow rate, initial com-  position of mobile phase : 18.2% (by vol.) MeOH, 75.8% 0.1M KH2PO4, 6% 0.02M MgCl2, final :after 4min, step increase to 27.8 % MeOH, 66.2%  0.1M KH2PO4, 6% 0.02M MgCl2)

Fig. 2 Separation of modified nucleic acid components by MECC

(current = 0.028 mA, injection  time = 5 sec, injection voltage = 5kv, separation voltage = 8kv , 0.008M SDS)

Oligo 14

Oligo 10

Oligo 12

Oligo 8

Oligo 12

Oligo 10

Oligo 8

Oligo 14

Fig.4 Isocratic and gradient separation of oligonucleotides using HPMC

stationary phase ; CIM disk, mobile phase ; (buffer A) 20mM Tris-HCl, pH8.5, (buffer B) 1mM sodium chloride in 20mM Tris- HCl pH8.5 flow rate 5ml/min, UV detector at 260nm, sample concentration 50 □g/ml, of each injection volume 20 □l.

(a) isocratic mode, mobile phase a mixture of 43% buffer A and 57%       buffer B

(b) gradient mode, X0=3mm