외래 단백질 생산을 위한 효모 발현 시스템

권 인찬, 한 규범

LG 화학 바이오텍 II 연구소

Yeast Expression System for the Production of Foreign Proteins

Inchan Kwon and Kyuboem Han

Biotech Research Institute II, LG Chemical Research Park, Taejon, Korea

서론

현재 사용되고 있는 여러 외래 유전자 발현 시스템 중에서 효모는 의약용 재조합 외래 단백질 생산에 매우 적합한 특성을 가지고 있다. 1981년 효모를 이용한 외래 유전자 발현이 최초로 보고된 이래, 효모는 단백질 의약품이나 백신 제조를 위해, 혹은 여러 종류의 생물에서 유래된 유전자의 발현을 연구하기 위해 광범위하게 이용되어 왔다. 효모 발현 시스템의 장점은 무엇보다도 상업적 scale-up의 용이성, endotoxin이 없는 안전성, 그리고 고등세포와 유사한 분비 시스템을 가지고 있다는 점이 특징으로 꼽히고 있다.

여기에서는 먼저 외래 단백질의 발현에 이용되고 있는 여러 효모들에 대해서 알아보고, 가장 많이 사용되고 있는 효모인 Saccharomyces cerevisiae에 있어서의 발현 시스템과 분비 시스템, 그리고 최근 연구가 활발히 되고 있는 효모 세포 표면에서의 발현에 대한 최근 연구동향에 대해 살펴보고자 한다.

효모의 종류

지금까지 다양한 효모들에서 외래 단백질의 발현이 연구되어 왔는데, 그 중에서 실제로 사용할 수 있는 수준으로 연구된 것은 다음과 같은 몇 가지 종류에 한정된다. 가장 널리 연구되고 있는 효모는 빵이나 술을 담그는데 주로 이용되는 S. cerevisiae이고, 그 이외의 효모들은 다음과 같다: methylotrophs (Pichia pastoris 및 Hansenula polymorpha); fission yeast (Schizosaccharomyces pombe); alkane-utilizer (Yarrowia lipolytica); lactase-producing yeast ( Kluyveromyces latis); amyloytic yeast (Schwanniomyces occidentalis).

여러 효모들 중에서 S. cerevisiae가 가장 널리 사용되는 이유는 유전자에 대한 정보가 잘 밝혀져 있고, 생리 특성에 대한 연구가 많이 되어 있으며, selection marker가 잘 정리되어 있고, 강력한 promoter들과 high-copy number의 plasmid가 잘 알려져 있기 때문이다. 그러나, 무엇보다도 GRAS (Generally Regarded As Safe) 균주로서 안정성에 관한 광범위한 자료가 있어서 의학용 단백질이나 백신 생산에 적합하기 때문이다.

그러나 S. cerevisiae는 다음과 같은 단점들이 보고되고 있어, 다른 효모들을 이용한 외래 단백질 발현연구가 많이 연구되고 있기도 하다: 몇 가지 예외를 제외하고는 생산 수율이 대체로 낮은 편이고; 삽입한 plasmid의 불안정성이 많이 보고되고 있으며; 분비된 glycoprotein은 hyperglycosylation이 일어나기 쉽고; 30kD 이상의 단백질의 경우 분비가 안 되는 경우가 많다.

Table 1 은 S. cerevisiae와 다른 효모 균주에서 외래 단백질의 발현을 연구한 결과를 요약해 놓은 것이다. 현재 추세는 S. cerevisiae의 단점 중에서 발현량 및 hyperglycosylation 문제없이 단백질을 생산할 수 있다라는 면에서 methylotrophic 효모에 대한 연구가 많이 행해지고 있는데, methylotroph의 안전성이 보완이 된다면 향후 보다 다양하게 사용될 것으로 예상된다.

Table 1. Comparative production of foreign proteins from yeasts (ref.1)

Protein	Host	Gene copy Number	Promoter	Productivity
HbsAg S	S. cerevisiae	> 50	PGK1	1-2*
	H. polymorpha	1	MOX1	0.15-0.2*
	H. polymorpha	~ 50	MOX1	2.7-3.6*
	P. pastoris	1	AOX1	2.3*
Murine EGF	S. cerevisiae	> 50	GAL7	0.62♀
	P. pastoris	1	AOX1	1.9♀
	P. pastoris	13	AOX1	22.4♀
IGF-1	S. cerevisiae	> 50	ADH2/GAPDH	25♀
	P. pastoris	6	AOX1	150♀
HSA	S. cerevisiae	> 50	CUP1	0.60♀
	P. pastoris	1	AOX1	15♀
Prochymosin	S. cerevisiae	1	GAPDH	17.8↕
	K. lactis	1	LAC4	345↕

*: mg per 100 mg protein,  ♀: mg protein per liter of culture,  ↕: untis per ml of culture

S. cerevisiae의 외래 유전자 발현 시스템

1) 발현 벡터

ARS (Autonomously replicating sequence)-based 벡터와 integration 벡터가 있다. ARS 벡터가 가장 널리 쓰이고 있는데, S. cerevisiae의 경우 2□ plasmid를 기반으로 한 것으로 안정적인 복제와 amplification을 가능하게 해 준다.  이러한 형태의 벡터가 가지는 중요한 특징은 원핵생물에서도 복제 및 amplification이 가능하다는 것이다.

Integration 벡터는 외래 유전자를 직접 효모의 chromosome에 삽입할 때 이용된다. 이것은 목적하는 유전자를 high frequency plasmid에 넣어 homologous recombination법에 의해 바로 효모의 chromosome에 삽입되고 도입된 유전자는 세포 분열에 따라서 안정적으로 복제를 반복하게 된다.

2) Selection Marker

Selection marker란 발현 벡터의 삽입 여부 확인 및 유지, 혹은 선별을 목적으로 사용되는 표지 유전자를 의미한다. 예를 들면, LEU2 (leucine), URA3 (uracil), HIS4 (histidine), TRP1 (tryptophan), 또는 LYS2 (lysine) 등과 같이 주로 아미노산 합성과 관련된 유전자를 이용한다.

3) Promoter

Promoter는 유전자의 발현을 조절하는 유전자를 의미하는데, 효모의 promoter들은 대부분 endogenous yeast gene에서 유래되었다. 지금까지 다음과 같은 효모 promoter들이 개발되었다: ADH-I (alcohol dehydrogenase 1); ADH-II (alcohol dehydrogenase 2); ENO1 (enolase1); ENO2 (enolase2); Galactokinase; GAP (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase); PGK (phosphoglycerate kinase); acid phosphatase; CYC1 (iso-1-cytochrom C); MFa1 (alpha-factor); CUP1; GUT2; SUC2; TRP5; GAL.

한편, 미생물 혹은 다른 효모에서 유래된 promoter들도 있는데, 예를 들면 다음과 같다: Candida tropicalis 유래 ICL (isocitrate-lyase) promoter; Kluyveromyces marxianus 유래 inulinase promoter; Bacillus amyloliquefaciens 유래 AMY (alpha-amylase) promoter; E. coli 유래chloramphenicol acetyltransferase promoter; E. coli 유래 aminoglycoside phosphotransferase-3 promoter.

또한, Promoter의 성능을 올리기 위해서 두 가지의 promoter를 fusion시키는 경우도 있다. ADH/GAP promoter는 조절은 ADH-II promoter로부터 가져오고 RNA polymerase binding 부위는 GAP promoter로부터 가져와 만들어졌고, ENO2/GAL1 promoter는 ENO2와 GAL1 promoter를 접합시킨 것이다.

4) Signal Sequence

효모에서 외래 유전자의 분비를 위해서는 hydrophobic한 polypetptide N-terminal extension이 필요한데 이것이 바로 signal/leader sequence이다. 이 sequence는 발현된 단백질이 ER (endoplasmic reticulum)에 translocation되어 밖으로 분비되도록 해준다. S. cerevisiae에서의 외래 단백질 분비에 사용된 signal/leader sequence에는 다음과 같은 것들이 있다: prepro MF□1 sequence; prepro HSA sequence; Kluyveromyces lactis 유래 prepro killer toxin sequence; HSA/MF□1 또는 killer toxin/MF□1 fusion sequence; galactokinase signal sequence; invertase signal sequence; bovine prolactin signal sequence; □-D-fructofuranosidase signal sequence; Kluyveromyces marxianus 유래 inulinase signal sequence; Saccharomyces diastaticus 유래 glucoanylase signal sequence.

Intracellular Expression

Signal sequence가 없으면 발현된 외래 단백질은 세포 내 축적된다. 이 경우 발현된 단백질이 대부분 inclusion body형태로 있기 때문에 단백질이 활성을 가지도록 원상화시키는 것이 문제이다. 따라서 정제 과정에서 원상화를 시키는 공정이 꼭 필요하게 된다. 또다른 문제는 N말단에 붙어있는 methionine을 제거 시켜야 하는 것인데 ubiquitin과 같은 다른 단백질을 fusion시켜서 제거시킬 수도 있으나 대부분 정제 공정에서 aminopeptidase를 이용하여 이를 제거시킨 후 methionine이 없는 천연형 단백질을 얻는다.

Extracellular Expression

S. cerevisae에서 외래 단백질의 분비 시 고려해야 할 사항들은 disulfide bond 형성, 분비율 향상, glycosylation, 그리고 N말단 변형문제 들이 있다.

1) Disulfide Bond 형성

Disulfide bond의 형성 및 분해는 산화-환원 반응이기 때문에 환경의 redox-potential의 영향을 받게 된다. 이러한 원리를 이해하고 배양액의 redox potential을 변화시키면 disulfide 결합을 조절할 수 있다. 예를 들어 redox potential을 산화조건으로 변화시키면 S. cerevisiae에서 인간 interferon-□의 분비 시 disulfide bond형성이 촉진될 수 있으며 반대로 배양액의 redox potential을 환원 조건으로 변화시키면 disulfide 결합의 형성이 억제된다.

2) 분비율 향상

S. cerevisiae에서의 외래 단백질의 분비량은 한계가 있어서 이를 높이고자 하는 다양한 연구가 진행되어 왔다. 돌연변이법을 이용해서 super-secretion 균주를 제조하려는 시도나 다양한 promoter 및 signal sequence의 조합을 시험해 보려는 시도가 있었다. 한편, 분비율을 개선시킨 특이한 경우로 배양액의 pH (혹은 redox-potential)을 변화시켰을 때, 분비율이 현저하게 증대된다는 것이 보고되었는데 인간 interferon-□의 분비에서 이러한 사실이 확인되었다.

3) N-Terminal Deletion

외래 단백질이 효모에서 분비될 때, 숙주에서 유래한 protease혹은 aminopeptidase등에 의해 단백질의 N말단 일부 아미노산 잔기가 잘릴 수 있다. 예를 들어 S. cerevisiae에서 인간 GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor)를 분비시킬 때, □-factor의 processing에 관여하는 효소인 dipeptidyl aminopeptidase에 의해 일부 아미노산 잔기가 잘리는데 이를 해결하기 위해서 dipeptidyl aminopeptidase가 제거된 효모 숙주를 사용한다.

효모 표면에의 발현

최근 외래 단백질을 효모의 표면에 발현시키는 방법이 연구되고 있다. 외래 단백질을 효모의 mannoprotein과 fusion시켜 발현시키면 이것이 anchoring protein역할을 해 줌으로써 외래 단백질이 효모 표면에 붙게 되는 것이다. 효모 표면 발현에 가장 널리 사용되는 □-agglutinin은 원래 mating □-factor의 분비에 관여하던 단백질이었는데 GPI를 가교로 glucan과 강하게 결합을 하는 성질 때문에 anchoring protein으로 널리 연구되고 있다. 실제로 사용되는 것은 C-말단의 반쪽인데 이 부분에는 serine과 threonine이 풍부하다고 알려져 있다. 이를 이용하여 □-galactosidase를 효모 표면에 발현시킨 예가 보고되었다.

또 하나의 주요한 anchoring protein은 flocculin인데 □-agglutinin과 비슷하게 serine과 threonine이 풍부하고 GPI와 연결되는 부위가 있다. 이외에도 Cwp1p, Cwp2p 그리고 Tip1p등의 anchoring protein들이 발견되었다.

이러한 표면 발현의 응용 분야는 다음과 같다: 효소의 세포벽에의 고정화를 통한 식품 등 첨가제 개발; 항체와 같이 특수한 결합 특성을 가진 단백질의 표면 발현을 통한 여러 가지 유용한 물질들의 discovery 및 정제; 항원성 단백질을 효모 표면에 발현시켜 경구용 생백신으로 사용; 폐수처리 등에 응용.

결언

효모는 인간과 가장 오래 관계를 맺어온 미생물 중 하나이기 때문에 안정성에서 큰 장점을 가지고 있다. 또한 외래 단백질을 외부로 분비할 수 있기 때문에 folding 문제가 있는 외래 단백질 발현에 유리하다. 이러한 측면 때문에 생산성이 대장균과 같은 박테리아 시스템이나 Aspergillus와 같은 곰팡이 시스템에 못 미치고, 동물세포가 구사할 수 있는 sophisticate한 외래 단백질들의 생산응용에는 어려움이 있더라도 계속적인 연구개발이 이루어지고 있다. 지금까지 알려진 효모의 문제점들이 계속 개선되고 있어서, 효모 발현 시스템을 이용한 지속적인 제품개발이 기대되고 있다.

참고문헌

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