AOT 역미셀을 이용한 BSA의 추출; 정추출과 역추출 조건의 영향

노선균, 강춘형.

전남대학교 공과대학 화학공학부, 전남대학교 고분자기술연구소

Extraction of BSA Using AOT Reverse Micelles; Effects of Forward and Backward Transfer Condition

Seon-Gyun Rho, Choon-Hyoung Kang

Faculty of Chem. Eng., Chonnam National University,

Polymer Science and Technology Research Center, Chonnam National University

서론

일상 생활에 널리 이용되고 있는 생물학적인 물질들은 혼합물인 상태로 존재하므로 특정성분만을 얻기 위한 분리 정제공정이 필요하다. 그러나 생물학적인 물질들은 외부환경의 작은 변화에도 파괴되거나 변성되므로 특별한 공정이 요구된다. 역미셀을 이용한 단백질 추출은 생물학적 물질들의 활성을 유지시키면서 빠른 시간 내에 많은 양의 단백질을 추출할 수 있다는 장점을 가지고 있기 때문에 광범위하게 연구가 진행되고 있다. 역미셀을 이용한 단백질 추출에는 수용액상의 pH, 염의 종류와 그 농도등이 가장 큰 영향을 미친다고 알려져 왔다. 이는 수용성 단백질의 경우 고유한 등전점을 가지고 있기 때문이다. 그러나 비교적 작은 단백질과는 달리 분자량이 큰 단백질의 경우에는 역미셀을 이용한 추출의 효율이 매우 낮기 때문에 폭넓게 사용하지 못한 실정이다. 실제로 분자량이 큰 단백질의 경우에는 역미셀 water pool의 평균 크기보다 더 큰 실험결과도 보고되어지고 있다. 따라서 분자량이 큰 단백질의 경우에는 추출 기구가 아직까지 잘 알려져 있지 않은 실정이다.

본 연구에서는 모델 단백질로서 BSA를 선택하였다. BSA는 분자량이 클 뿐만 아니라 나선형의 구조를 가지고 있다. 이런 이유로 역미셀을 이용한 이전의 BSA 추출에 대한 연구는 광범위하게 진행되지 못하고 있다. 특히, 대부분의 BSA에 대한 연구에서는 일반적으로 유기상에 직접 단백질을 가용화시키는 방법인 주입법을 사용하고 있다[1]. 본 연구에서는 상 접촉법을 이용하여 정추출과 역추출할 때 추출 변수인 pH, 염의 종류 그리고 농도에 따른 추출 효율을 관찰하였으며 이때의 역미셀의 크기를 측정 하였다. 이는 분자량이 비교적 큰 단백질들에 대한 보다 효과적인 추출 공정의 운전조건을 제시하고자 하는데 그 목적이 있다.

실험

본 실험에서는 분자량은 65,000이고 등전점이 4.9인 수용성 단백질인 BSA (Sigma Type A-7906)를 모델 단백질로 사용하였다. 역미셀을 형성하는 계면활성제인 AOT는 sigma사로부터 구입하였으며, 유기용매인 isooctane(99.0%이상)은 YAKURI사로부터 구입하였다. 수용액상의 염의 종류와 농도에 따른 영향을 파악하기 위해 사용된 염은 1:1 염인  KCl과 NaCl 그리고 1:2 염인 MgCl2와 CaCl2를 사용하였다. 위의 시약들은 모두 정제과정없이 사용하였으며 수용액상에 사용된 완충용액은 10mM acetate 완충용액을 제조하여 사용하였다.

정추출에 사용된 수용액상은 완충용액과 적당한 염의 농도 그리고 1mg/ml의 단백질로 이루어져 있으며 유기상은 200mM AOT/isooctane으로 이루어져 있다. 실험은 직경  20mm의  glass vial에서 수용액상 5ml와 유기상 5ml를 각각 제조하여 자석식 교반기를  이용하여 약 2시간 정도 혼합한 다음 20℃로 유지되는 항온조에서 약 3일 이상 방치 한 후 실행하였다. 상 분리가 완전히 이루어진 후 수용액상과 유기상으로부터 각각의 시료를 채취하여 280nm에서 분광광도계(Bausch & Lamb사의 Spectronic21)을 이용하여 잔류 단백질의 농도를 분석하였다.

역추출 실험은 정추출 효율이 최소값인 조건이 역추출 효율에서 최대가 되기 때문에 역추출 수용액상은 pH=8로 고정하여 사용하였으며 염은 KCl을 사용하였다. 수용액상의 KCl 농도는 각각 0.1, 0.3, 0.7, 1.0, 2.0, 4.0M에서 실험하였다. 유기상은 정추출된 유기상의 시료를 사용하였다.

결과 및 고찰

추출실험에 사용한 계면활성제인 AOT는 음이온을 띤 친수성의 머리부분과 2개의 소수성 꼬리부분으로 구성되어 있다. 이런 구조적 성질로 인하여 수용액상과 유기상이 접촉할 때 친수성인 머리부분이 수용액과의 인력에 의해 역미셀을 형성하게 된다. 적절한 조건에서 역미셀이 형성되면 소수성 부분의 꼬리들이 수용액과의 반발력에 의해 유기상으로 이동하게 된다. 이런 원리를 이용하여 수용액상에 녹아있는 단백질을 유기상으로 추출할 수 있게 된다.

그림 1은 수용액상의 염의 종류와 pH변화에 따른 단백질 정추출 효율의 영향을 나타내었다. 모든 염들은 최고의 추출 효율을 나타내는 점을 보였다. 특히 비교적 크기가 작은 단백질들을 다룬 기존의 실험들에서 음이온 계면활성제의 경우 등전점 이하의 pH에서 더 좋은 정추출 효율을 보이는 반면, 분자량이 크고 나선형의 구조를 가지는 BSA의 경우에는 등전점 이하의 pH에서 상호 작용하는 힘보다 등전점 이상에서 작용하는 힘이 더 크게 작용함을 알 수 있다. 본 연구의 결과에서 1:1 염의 경우 매우 좁은 pH영역에서 최고점의 정추출 효율을 보였다.  1:2 염의 경우 등전점 이하에서는 pH가 감소함에 따라 정추출 효율은 매우 급격히  감소하는 경향을 보였다.

또한 최고점 이하의 pH에서 CaCl2가 MgCl2보다 더 높은 정추출 효율을 보인 반면에 최고점 이상의 pH에서는 MgCl2가 더 높은 정추출 효율을 보였다. 이는 최고점 이하의 pH에서 CaCl2가 MgCl2보다 단백질과 계면활성제 사이의 상호 작용하는 인력이 더 크기 때문이다. 그리고 일반적으로 등전점 이상의 pH에서 1:2 염이 1:1 염보다 더 높은 정추출 효율을 보임을 알 수 있었다. 이러한 염 종류에 따른 정추출 실험의 결과는 계면장력이 염의 종류에 따라 서로 다르기 때문에 염의 분배계수 영향으로부터 기인하는 것으로 추정할 수 있다.

역미셀을 이용한 단백질 추출에서 가장 지배적인 인자 중의 하나는 염의 종류와 농도이다. 계면활성제인 AOT는 친수성기와 소수성기를 동시에 가지고 있는 양친매성 물질이다. 이런 성질 때문에 AOT는 수용액상과 유기상에 존재할 수 있다. AOT가 두 상 사이에 존재할 수 있는 조건은 매우 낮은 염 농도일때 AOT는 수용액상에 존재하며, 높은 이온강도에서는 모든 AOT는 유기액상에 존재하게 된다. 이는 이온강도가 증가함에 따라 AOT친화력은 유기액상에 호의적으로 변함을 알 수 있다. 본 연구의 실험에서도 이런 이유로 매우 낮은 염 농도에서 수용액상의 혼탁현상을 경험하였으며 더 이상 액-액 상분리 실험을 수행할 수 없었다.

그림 2는 일정한 pH에서 염의 종류와 농도에 따른 정추출 효율을 나타내었다. KCl의 경우 염 농도가 증가함에 따라 정추출 효율은 급격히 감소하였으며 0.7M 이상에서는 더 이상의 추출은 일어나지 않았다. NaCl의 경우 약 1M까지는 염농도가 증가함에 따라 정추출 효율은 증가하지만 약 1M 이상에서는 급격히 감소하여 더 이상 추출되는 단백질은 검출되지 않았다. 1:2 염인 MgCl2의 경우 약 0.3M에서 최저점의 정추출 효율을 보였으며 약1M 이상에서는 거의 일정한 값을 보였다. 더욱이 CaCl2의 경우 낮은 염 농도와 높은 염 농도에서 정추출 효율이 약간 감소하는 경향을 보였다. 특히 1:1 염의 경우 매우 높은 염 농도에서는 정추출 효율이 급격히 감소하였다. 이는 매우 높은 염 농도에서 수용액상의 전하 밀도가 증가하여 단백질과 계면활성제 사이의 상호 작용하는 인력이 급격히 감소함을 보여준다. 그러나 1:2 염의 경우 높은 염 농도에서 정추출 효율은 약간 감소하는 경향을 보였다. 이는 1:2 염의[eqn: RM Ca^2+]와[eqn: rm Mg^2+]가 단백질과 계면활성제 머리부분 사이에 다리 역할을 하게되어 매우 높은 염 농도에서도 정추출될 수 있기 때문으로 생각된다.

이런 결과로부터 역추출 효율의 조건은 쉽게 결정될 수 있다. 그림 1과 2를 종합하여 볼 때 역추출 수용액상의 조건은 1:1 전해질의 높은 pH조건과 높은 염농도에서 쉽게 역추출 할 수 있음을 보여준다. 그림 3은 pH=8인 조건과 1:1 전해질인 KCl 농도에 따른 역추출 효율을 도시하였다. 정추출 조건의 1:1 전해질인 NaCl은 약 95% 이상의 역추출 효율을 보였으며 염 농도가 증가함에 따라 점점 증가하였다. 그러나 정추출 조건이 1:2 전해질의 경우 약 0.3M KCl 농도까지는 역추출된 단백질은 10%이하의 매우 작은 양만이 추출된 반면 KCl 농도가 0.3M 이상에서는 역추출된 단백질의 양은 급격히 증가하였다. 이는 유기상에 존재하는 역미셀속의 단백질과 1:2 전해질들이 계면활성제 머리부분과의 상호작용하는 인력이 1:1 전해질보다 훨씬 강하게 작용하고 있음을 알 수 있다.

그림 4는 계면에서 침전되는 단백질의 정도를 도시한 그림이다. pH가 증가함에 따라 침전의 정도는 매우 급격히 감소하였다.

그림 5와 6은 정추출과 역추출할 때 유기상에 잔존하는 수분 함량을 각각 도시한 그림이다. 염 농도가 증가함에 따라 유기상에 잔존하는 수분함량은 감소함을 알 수 있다. 이는 KCl 농도가 증가함에 따라 유기상에 잔존하는 역미셀의 크기가 점점 작아지며 따라서 역추출 효율이 증가함을 알 수 있다.

본 연구의 결과로부터 최대 역추출 효율은 높은 pH와 1:1 전해질의 높은 이온강도의 수용액상 조건에서 효과적임을 알 수 있었다.

결론

본 연구에서는 20℃에서 음이온 계면활성제인 AOT와 isooctane으로부터 형성된 역미셀을 이용하여 BSA인 모델 단백질을 정추출과 역추출 분리 실험을 행하였다. 특히 pH, 염의 종류와 농도에 따른 각 단백질의 정추출과 역추출의 정도 와 그때의 역미셀의 크기를 관찰하였다.

1. 수용액상에서 혈청 단백질인 BSA의 분리는 등전점 이상 pH에서 분리 되었으    며 0.1M 염에서 KCl, NaCl, MgCl2, CaCl2 의 경우 pH는 5, 5.5, 7, 5 근처에서    최대 정추출 효율을 보였다.

2. 일정한 pH에서 염 농도가 증가함에 따라 CaCl2와 NaCl의 경우 정추출 효율    은 증가하였으며 높은 염 농도에서는 감소하였다.

3. 정추출의 경우 MgCl2는 pH변화에 관계없이 W0=20의 거의 일정한 값을 보인    반면 CaCl2와 KCl의 경우 염 농도가 증가함에 따라 W0는 감소 하였으며 역    추출의 경우는 KCl 농도가 증가함에 따라 유기상에 잔존하는 수분 함량은 감    소함을 알 수 있다.

4. 역추출의 경우 등전점 이상의 높은 pH와 높은 염농도에서 최고의 역추출

효율을 보였다.

참고문헌

1. Shiomori, K., Kawano Y., Kuboi, R. and Komasawa, I., □Effective purification method of large molecular weight proteins using conventional AOT reverse micelles□(1995), J. Chem.. Eng. Japan., 28, 803-809

Fig. 1 Forward extraction effect of pH and     Fig. 2. Forward extraction effect of salt

salt type in 1 mg/ml BSA at 0.1M salt.         concentration and type in 1mg/ml BSA.

Fig. 3 Effects of salt concentration on           Fig. 4 Precipitation effects of pH and salt type  backward extraction of BSA.                    on forward extraction of BSA(0.1M salt)

Fig. 5 Forward extraction effects of salt types   Fig. 6 Backward extraction effects of salt types  and its concentration on water content,W0        and its concentration on water content, W0