Gradient-Mode HPLC에서

수학적 모델을 이용한 체류시간의 예측

이주원, 노경호

초정밀분리기술센터, 인하대학교, 화학공학과

Prediction of Retention Times

by Mathematical Model in Gradient-Mode HPLC

Ju Weon Lee, Kyung Ho Row

Center for Advanced Biosepration Technology, Dept. of Chem. Eng., Inha Univ., Inchon 402-751, Korea

서 론

방향족 탄화수소는 원유의 24~27%를 구성하고 있으며, 원유성분 중 독성이 가장 큰 화합물로 알려져 있다. 특히 단핵 방향족 탄화수소인 benzene, toluene, xylene의 경우에는 많은 양이 생산되며 산업공정 중에서 주로 연료 첨가제, 도료공업, 접착제, 칠기, 광택제, 잉크, 가죽공업 등에 광범위하게 사용되고 있다. 이 물질들은 매우 적은 농도에서도 발암성과 신경계 등의 독성을 나타내어 BTX 분해작용과 제거에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

액체 크로마토그래피를 이용한 생화학적 물질의 분리에 대한 관심이 높아짐에 따라서 분리의 최적화를 이루는 실질적인 문제에 대해서 관심의 초점이 모아지고 있다. 최적화 대상은 물질의 분리도, 분리시간, 최대의 분리가 가능한 양이다. 물질의 분리도는 두 인접 피크간의 체류시간의 차이와 기준선에서 피크의 평균 폭에 의해서 정의된다. 분리도를 크게 하기 위해서는 column 내에서의 체류시간의 차이가 분명히 존재하여야 한다. 분리도는 가장 우선 다루어져야 하고 이를 위해서 이동상의 종류와 조성에 대한 최적화가 이루어져야 한다. 체류시간 대신에 dead time을 고려한 체류인자(retention factor)를 사용하여 분리도를 표시한다. 이동상의 최적화는 실험에 의하여 결정하거나 체류시간에 대한 수학적 모델식에 의하여 이루어지게 된다. 전자는 최소한의 실험으로부터 이동상의 조성을 얻기 위하여 통계적인 방법, 다양한 함수(주로 다항식)의 형태로 표시하는 방법이 사용된다. 후자는 체류인자와 이동상에 대한 체류 메카니즘에 대한 모델식을 이용하는 방법[1,2]으로 이동상의 조성에 대한 최적화뿐만 아니라 쉽게 적용할 수 있는 방법이다. 또한, 이동상의 조성을 변화시키는 구배용매조성법(gradient mode)은 일정용매조성법(isocratic mode)에 비해서 짧은 분리시간, 보다 향상된 분리도, tailing이 작은 피크 등의 장점이 있다.

본 연구에서는 계단함수 및 선형함수의 구배용매조성법에서 체류시간을 예측하기 위해서 실험적으로 체류인자를 예측하는 Snyder model을 사용하여 체류인자와 이동상 조성의 관계식을 구하고 이 관계식으로부터 구배용매 조성법에서의 체류시간을 수학적 모델로 구하였으며 Gaussian distribution을 이용하여 용출곡선을 예측하였다.

이 론

분석용 HPLC에서의 흡착평형은 선형으로 표현할 수 있으며 이흡착식은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

[eqn: C=K CDOT q]	(1)

여기서 C는 이동상에서의 용질의 농도이며, q는 고정상에서의 용질의 농도이고 K는 평형상수이다. 또한 평형상수와 체류인자와의 관계는 다음과 같이 나타낼 수 있다.

[eqn: k=F cdot K]	(2)

여기서, F는 phase ratio이다. 체류인자와 이동상의 조성과의 관계에 대한 모델은 Snyder에 의하여 제안된 다음의 식을 사용하였다[3].

[eqn: k=k_0 e^ {-S cdot F_M}]	(3)

여기서, k0와 S는 매개변수이며, FM은 이동상에서의 유기용매의 부피분율이다.

축방향 확산과 다른 두 이동상 간의 섞임 효과(mixing effect)를 무시한다고 가정하면, 다음과 같은 물질수지식을 얻을 수 있다[4].

[eqn: { PARTIAL C } over {partial t } +F { partial q} over {partial t } +u {partial C } over {partial z } =0]	(4)

여기서, u는 이동상의 선속도이다. 위의 식에서 유도된 용질의 이동은 다음의 식으로 표현된다.

[eqn: u_s = u over {1+ k(t)}]	(5)

용질의 체류시간과 bandwidth를 구할 수 있다면, Gaussian distribution으로부터 용출곡선을 얻을 수 있으며 Gaussian profile은 다음과 같다.

[eqn: C_eff = 2 A over {w SQRT { pi/2}} exp LEFT ( - 1 over 2 {(t-t_R)^2} over w^2 RIGHT )]	(6)

여기서, A는 peak의 면적이고, Ceff는 컬럼의 출구에서의 용질의 농도이며, w는 peak의 나피, tR은 peak의 체류시간이다.

실 험

일곱 개의 방향족 화합물 (benzene, chlorobenzene, toluene, styrene, o-dichlorobenzene, p-dichlorobenzene, m-xylene)을 메탄올에 20 □/□로 희석하여 사용하였다. 이동상으로는 물, 메탄올, 아세토나이트릴을 사용하였다. HPLC는 Waters 사의 515 pump, 600S controller, 486 UV detector와 CHROMATE Ver 3.0 (Interface Engineering)를 사용하였다. 컬럼은 OptimaPak C18 (RS Tech., Korea, 250□4.6□)를 사용하였다. 주입부피는 1□, wavelength는 254□, 이동상의 유량은 1 □/min으로 고정하였다. 일정용매조성법에서, 두가지의 이성분계 이동상 물/메탄올, 물/아세토나이트릴의 조성은 메탄올의 경우에 65, 70, 75, 80, 85, 90 (vol. %)로 변화시켰으며, 아세토나이트릴의 경우에는 55, 60, 65, 70, 75, 80 (vol. %)로 변화시켰다.

결과 및 고찰

Fig. 1은 일정용매조성법에서 실험적으로 구한 체류인자와 식 (3)으로 계산된 체류인자를 비교한 것으로 두가지 유기용매에서 잘 일치하고 있는 것을 보인다. 이 data를 이용하여 구배용매조성법에서의 체류시간을 예측한다. Fig. 2는 각 물질과 각이동상의 조성에서의 N값을 나타낸 것이다. N값은 약 2000정도의 값에 집중해 있으며 각 물질의 N값의 평균값을 사용하였다. Fig. 3은 이동상이 물/메탄올의 경우에 실험으로 구한 크로마토그램과 계산된 elution curve를 비교한 것으로 linear gradient 조건으로 물/메탄올 = 30/70에서 10분동안 선형적으로 물/메탄올 = 10/90으로 메탄올을 증가시켰으며, 잘 일치함을 보이고 있다. Fig. 4는 이동상이 물/아세토나이트릴의 경우에 실험으로 구한 크로마토그램과 계산된 elution curve를 비교한 것으로 linear gradient 조건으로 물/아세토나이트릴 = 30/70에서 30분동안 선형적으로 물/아세토나이트릴 = 50/50으로 아세토나이트릴을 감소시켰으며, 잘 일치함을 보이고 있다. 메탄올의 경우에는 모든 물질이 완전히 분리되었으나 아세토나이트릴의 경우에는 chlobenzene, toluene, p-dichlorobenzene, m-xylene이 분리가 안된 것을 알 수 있다.

이 방법을 사용하여 이동상 조성 및 구배조건을 이용하여 용출곡선을 계산할 수 있기 때문에 분석용 뿐만 아니라 제조용 크로마토그래피 공정에 이용될 예정이다. 이동상의 조성에 따른 체류인자의 data를 실험적으로 최소한 2개를 얻어 식 (3)의 실험상수를 구할 수 있고 구배용매조성법의 조건으로 수학적 모델을 적용하여 용출곡선을 구할 수 있는 것이 본 연구의 특징이다. 물질을 분리하기 위한 최적 이동상의 조성과 구배시간을 실험적으로 구하기 위해서는 많은 실험을 시행오차적으로 수행하여야 된다. 그러나 이동상의 조성에 따른 체류인자를 식 (3)에 의한 이동상 조성의 함수로 나타내고 계단 및 선형함수인 경우 용출곡선을 예측할 수 있다. 따라서 실험횟수를 크게 줄일 수 있기 때문에 신속하게 최적 분리조건을 얻을 수 있다.

참고문헌

1. 이 주 원, 노 경 호 : 화학공학, 35, 769 (1997).

2. 이 주 원, 노 경 호 : 공업화학, 8, 694 (1997).

3. Lee, Y.W., So, M.S., Lee,J.W., Chung, S.T., Row, K.H. : Korean J. of Chem. Eng., 13, 578 (1996).

4. 노 경 호 : 액체 크로마토그래피의 원리와 응용, 인하대학교 출판부 (1999)

알 림

본 연구는 초정밀분리 기술 센터의 연구비지원에 의해서 수행되었습니다.