음이온 교환막에 의한 Oligomers 분리 특성

최 두 영·김 정 일·선 향*·노 경 호

인하대학교, 화학공학과

*기술표준원, 섬유과

Separation Characteristic of Oligomers

by Anion Exchange Membranes

Du Young Choi, Jung Il Kim, Hyang Sun*, Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University, Inchon 402-751, Korea

*Agency for Technology and Standards. MOCIE

서론

최근 유전공학이나 생명공학이 각광을 받게 되면서 genes와 관련된 물질이 많이 연구되고 있다. 특히 antisense 의약품을 이용한 유전자 치료법이 있다. 이 유전자 치료법은 체내의 유전정보의 흐름을 잘 파악하여 정상적인 활동에 꼭 필요한 단백질을 공급하거나, 불필요한 단백질을 성장 이전 단계에서 차단하여 생성을 억제해 줌으로써 정상적인 기능을 되찾아 주는 치료법이다[1]. 불필요한 단백질 경우, 그 생성에 기인하는 mRNA의 염기 서열이 가장 큰 영향을 주는데, Oligodeoxynucleotide (ODN)는 생체 내에서 특정 염기서열을 갖고 있기 때문에 면역조절을 할 수가 있다[2]. 불필요한 단백질의 mRNA의 서열에 상보적으로 결합을 할 수 있는 ODN을 합성하여, 표적세포 내로 전달해 주어 표적 mRNA와 ODN 사이에 강한 수소결합을 유도시킨다. 그 결과 mRNA가 불필요한 단백질을 생성하지 못하게 되어 그 단백질 때문에 생길 수 있는 각종 질병의 치료제로 사용이 된다. 또한 면역세포를 활성화시키거나 이들의 기능을 억제하는 특정 염기서열은 ODN 자체의 형태로 이용될 수도 있고, plasmid DNA안에 삽입되어 그 효과를 나타낼 수도 있다. 특히 암, 관상 동맥계 질환(동맥경화, restenosis 등), 여러 종류의 감염성 질병 등을 위한 백신 보조제 및 치료제로 ODN을 이용할 수 있다는 가능성을 보였으며, 또한 후천성면역결핍증 등이 대표적인 치료대상이 된다[3].

분리기술은 혼합물을 신속하고, 고순도로 정제하는 것이 중요하다. 여러 가지 정제 기술 중에서 고성능 막 크로마토그래피(High-Performance Membrane Chromatography, HPMC)는 최근 들어 많은 연구가 진행되고 있고 생 고분자물질의 분리와 정제에 탁월한 효과가 있다[4]. 현재 가장 효율적인 HPMC 분리 기술에서 사용하고 있는 막의 형태는 미세공 조직을 가진 평막과 중공사막, membrane stacks, radial flow cartridge로 분리되고 이들을 고정상으로 사용한다. 분리의 메카니즘은 친화력, 이온교환, 소수성 상호작용과 역상, 복합 방법 크로마토그래피이다[5]. 막에서는 세공크기와 흡착에 의한 물질의 분리가 이루어지는 반면 기존의 고성능 액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography; HPLC)에서는 컬럼에 충전된 흡착제와 이동상간의 확산, 입자사이의 흡착과 탈착의 메커니즘으로 분리가 되는데 상용되는 흡착제의 대부분은 다공성 입자이다. HPMC 메커니즘 중에서 본 실험에서 사용한  Monlithic Convective Interaction Media(CIM)은 이온교환 작용에 의해서 분리가 되며, 특히 CIM disk 중 DEAE(diethylaminoethyl)와 QA(quaternary amine)는 음이온교환 disk로disk의 음이온 교환 작용기와 단백질 분자들이 이동상조성에서 해리가 되면서 단백질 분자들은 음이온의 성질을 가지게 되고, disk의 활성화된 작용기 (DEAE, QA)는 양이온의 극성을 가지게 되면서 분리가 일어나게 된다[6]. 이때 단백질 분자의 등전점(isoelectric point)과 buffer인 염의 농도가 중요한 분리 메카니즘의 인자로 작용하게 된다[7].

본 연구의 목적은 ODNs(8, 10, 12, 14, 15, 16 mers)를 음이온 교환막을  이용하여 분리하는 것이다. ODN을 분리하기 위한 메카니즘은 이온교환 작용이며 정지상은 약 음이온 교환막인 DEAE disk와 강 음이온 교환막인 QA disk사용하여 실험하였고 그 결과에 따른 분리 특성을 비교하는 것이다.

실험

1. 시약 및 기기

본 실험에 사용된 oligodeoxynucleotides는 Sigma에서 구입하였고 oligodeoxynucleotide 8(oligo 8), C CAT GTC T3'; oligodeoxynucleotide 10(oligo 10), GTC CAT GTC T3'; oligodeoxynucleotide 12(oligo 12), AC GTC CAT GTC T3'; oligodeoxynucleotide 14(oligo 14), C GAG GTC CAT GTC T3'C GAG GTC CAT GTC T3'; oligodeoxynucleotide 15(oligo 15), CC GAG GTC CAT GTC T3' ; oligodeoxynucleotide 16(oligo 16), GCC GAG GTC CAT GTC T3를 사용하였다. 고정상으로는 직경이 16mm, 두께가 3mm인 Monolithic Convective Interaction Media(CIM) 약 음이온 DEAE와 강 음이온 QA disk 사용하였다. HPLC는 WatersTM사의 616 펌프(multisolvent delivery system), 486 Tunable Abasorbance Detector, 600 Controller, Rheodyne 주입기(50□ sample loop)를 사용했다. 데이터 저장 시스템은 Chromate(ver. 3.0, Interface Eng.)를 사용하였다.

2. 방법

본 실험에서는 약 음이온 교환막인 DEAE와 강 음이온 교환막인 QA disk를 고정상으로 하고 이동상은 buffer A(20mM Tris-HCI, pH 7.45)와 buffer B(buffer A + 1M NaCl)를 사용하였다. 시료 주입량은 20□이며 wavelength 260nm, 유속은 4 □/min로 실험하였다.

결과 및 고찰

Fig. 1과 Fig.2는 정지상을 QA disk로 사용하여 분석한 그림이다. 먼저 Fig. 1은 ODNs를 선형 구배용매 조성법을 사용하여 분리한 그림이다. 각각의 ODN들이 분리되지 않았고 선형 구배용매 조성법으로 여러번의 실험을 한 결과 ODNs가 분리 되지 않았다. Fig. 2는 단계 구배용매 조성법을 사용하여 ODNs를 분리한 그림이다. Buffer B에 포함된 NaCl의 양을 단계 함수적으로 높인 결과 ODNs를 분리할 수 있었다. Fig.3과 Fig. 4는 정지상을 DEAE로 사용하여 ODNs를 분리한 그림이다. Fig. 3은 일정용매 조성법을 사용하여 ODNs를 분리한 그림으로 8, 10, 12 mer는 분리가 되었지만 나머지 ODNs는 분리가 되지 않았다. Fig 4. 는 선형 구배용매 조성법을 사용하여 ODNs를 분리한 그림이다. 구배 시간을 2분으로 하여 NaCl의 양을 서서히 증가시킨 결과 각각의 ODN에 대하여 좋은 분리도를 얻을 수 있었다. Fig. 2. 와 비교해 볼 때 분리도가 크게 증가되고, 분석시간이 15분 가량 단축되는 것을 알 수 있다. 따라서 강 음이온 교환막인 QA disk 보다는 약 음이온 교환막인 DEAE disk가 더 효율적인 분석 방법임을 비교 확인 할 수 있었다.

알림

본 연구는 인하대학교 고순도 분리연구실에서 수행하였으며 기술표준원 산업기반 연구개발의 지원에 감사드립니다.

참고문헌

1. B. Mui, Q. F. Ahkong, L. Chow, M. J. Hope, J. Biochem. et Biophys.  Acta., 1467, 281 (2000)

2. Jack S. Cohen, Oligodeoxynucleotides, MACMILLAN Press, London, p211 (1989)

3. Rey-Heng Hu, Shu-Hsun Chu, Int. J. of Immunopharma., 22, 445 (2000)

4. Dongmei Zhou, Hanfa Zou, Jianyi Ni, Hailin Wang, Li Tang, Yukui Zhang, Chromatographia, 50, 27 (1999)

5. Xianfang Zeng, Eli Ruckenstein, Biotechnol. Prog., 15, 1003 (1999).

6. Lian Shan, David J. Anderson, J. Chromatogr. A, 909, 191 (2001)

7. Xianfang Zeng, Eli Ruckenstein, J. of Membrane Science, 148, 195 (1998)

Figure 1. Chromatogram of oligodeoxynucleotides in linear gradient      mode. (QA disk, Buffer A/Buffer B = 80/20-60/40-50/50 vol.%)

Figure 2. Chromatogram of oligodeoxynucleotides in step gradient mode.

(QA disk, Buffer A/Buffer B = 80/20-75/25-70/30-65/35-60/40- 55/45-50/50-45/55 vol.%, each gradient time 2min)

Figure 3. Chromatogram of oligodeoxynucleotides in isocratic mode.

(DEAE disk, Buffer A/Buffer B=50/50 vol.%)

Figure 4. Chromatogram of oligodeoxynucleotides in gradient mode.

(DEAE disk, Buffer A/Buffer B=50/50-20/80 vol.%, gradient time 2 min)