소포로리피드의 생합성에서 pH의 영향에 따른 수율비교와

산형 소포로리피드로의 치환

전재춘. 김경준. 임경희

중앙대 화학공학과

Effect of pH on Sophorolipid Production Yield

and Synthesis of Acidic Sophorolipid

Jae-Choon Jeon, Kyong-Joon Kim, Kyung-Hee Lim

Department of Chemical Engineering. Chung-Ang University

서론

계면활성제는 친수성기와 친유성기를 동시에 가지고 있는 물질로 산업전반에 널리 쓰이고 있으며 그 수요도 계속 증가하고 있다. 하지만 이러한 계면활성제는 수질오염의 문제를 안고 있다. 따라서 환경 친화적인 생체계면활성제가 관심의 대상이 되고 있다. 생체계면활성제는 미생물의 근원이나 화학적 조성에 따라 분류되는데 이중 하나인 소포로리피드는 낮은 계면장력을 나타내고 pH와 염의 농도 및 온도변화에 대하여 현저한 안정성을 나타낸다. 이러한 특성을 이용해서 화장품이나 의약, 환경오염물질을 제거하는데 사용될 수 있는 소포로리피드(SL)를 생합성하였다. 생체계면활성제는 생산균주가 성장기 또는 휴지기에서 영양원인 질소원이 결핍된 상태에서 물에 불용성인 기름을 탄소원으로 체내에 흡수하기 위하여 체외로 기름을 유화 시킬 수 있는 물질인 계면활성제를 내는 성질을 이용하여 생산하는데[1] 이와같은 질소제한법을 이용하였다. 발효를 할 때 최적 pH는 3.5라고 알려져 있다. 그래서 초기 조건부터 pH를 3.5로 적정했을 때와 pH를 조절하지 않은 상태의 두가지 실험 수율을 비교하였다. 소포로리피드는 정제하지 않은 상태에서는 구조가 6∼12개 정도가 혼합되어있다. 이러한 추출된 혼합물중 유화능이 우수할 것이라 예상되어지는 친수기와 친유기의 구분이 뚜렷한 구조를 가지는 산형 소포로리피드를 합성하였다.

실험

동결건조한 Candida bombicola(ATCC 22214)를 YM agar를 증류수에 녹이고 살균한 petridish에 고체배양하고 48시간동안 두 번 접종하였다. 이것을 glucose와 효모추출물, 무기염 등을 넣은 액에 접종하고 150□씩 삼각플라스크에 담아 72시간동안 액체 배양시켰다. 액체 배양 후에 5□발효조에 3□배양액을 넣고 접종한 후 72시간 발효시키고 2차 탄소원인 safflower oil을 300□넣어 86시간 발효시켰다. 같은 방식으로 발효조에 접종할 때부터 pH를 3.5로 적정하여 실험을 다시 하였다.

발효액 100□를 분별깔때기에 넣고 3배인 ethyl acetate 300□를 넣고 잘 섞어준 다음 상등액을 분리하여 증발기로 감압 증류하였다. 증류하면 점성이 많은 물질이 된다. 이 물질에 헥산으로 3번 씻어주어 남아있는 기름을 제거하면 흰 고체가 된다.

이 crude 물질 100□에 메탄올 5□, 물 5□, KOH 1.5g을 넣고 30분동안 가열하였다. 상온으로 다시 냉각한 다음 황산용액으로 pH 3.0까지 적정하고 메탄올 20□를 추가로 넣었다. 침전물을 필터로 거른 후 다시 증발시키면 alkyl-sophorolipid가 얻어진다[1,2].

결과 및 결론

1) 발효중 샘플 10□를 취하여 3배의  ethyl acetate로 추출후 증발시키고 난 후의 crude-sophorolipid의 구조는 Figure 1 과 Figure 2에 나타내었다.

100 □의 최종샘플을 같은 방법으로 추출하고 Hexane 으로 잔류오일을 제거하고 각각 3번씩 발효한 crude sophorolipid의 양을 평균하여 1차탄소원과 2차탄소원에 대한 그래프는 Figure3과 Figure4,  Yield는 Table 1에 나타내었다.

[eqn: {Y}_{G}={mass```of```` sophorolipid}over{mass```of``` Glucose}]  [eqn: {Y}_{S}={mass```of```` sophorolipid}over{□```of``` safflower```Oil}]

Condition	pH 무시	pH 3.5
sophorolipid (g/□)	32	41
[eqn: {Y}_{G}]	0.32(g/g)	0.41(g/g)
[eqn: {Y}_{S}]	0.32(g/□)	0.41(g/□)

Table 1

위의 결과로부터 같은 시간동안 pH 3.5로 적정하여 발효하면 25%정도 crude SL의 양을 증가시킬 수 있었다. 하지만 소포로리피드의 양이 pH를 무시 하였을 경우는 천천히 증가하는 경향을 보였고 pH를 3.5로 적정하여 유지시켜주었을 때는 급격히 소포로리피드의 양이 증가하는 경향을 알 수 있었다. 2차 탄소원인 safflower oil이 급격히 소비가 된 경우 biomass가 다시 증가하면서 소포로리피드의 양이 반대로 급격히 줄어드는 경우가 많으므로 발효를 하면서 주의를 해야한다. 이러한 경우는 최종 156시간이 흐른 경우이며 다른 경우의 절반 정도의 SL양이 추출되었다(Figure 5). 같은 시간인 156시간 후에 pH의 영향을 비교했는데 pH무시와 pH 3.5로 조절한 실험의 소포로리피드 최적시간이 다르므로 최대 소포로리피드 생산시간에 발효를 멈추어야 한다.

2)소포로리피드의 구조는 크게 락톤형과 산형으로 구분할 수 있다.  crude SL은 이 두 형태가 섞여져 있는데 유화능이 좋을 것이라 예상되는 친수기와 소수기가 뚜렷한 산형을 만들기 위해 ROH/H2SO4 또는 ROH/KOH 로 합성을 하였다.[3,4] 메탄올을 사용하면 지질 끝부분에 -CH3기가 붙으며 합성으로 순수한 Methyl-SL를 얻을 수 있었다. NaOR을 이용하면 Methyl∼Decyl등 원하는 구조로 만들 수 있다[4]. 합성이 끝나고 난 후의 Methyl-SL은 흰 분말이다. 이것을 분석해 보면, 반응시키지 않은 Crude sophorolipid는 구조에 따라 TLC에서 spot이 6∼12정도 나오는데 치환을 한 후에는 아랫부분에 spot이 하나만 나타난다. 전개용매 비율이[eqn: {CHCl}_{3}/{CH}_{3}OH/{H}_{2}O] = 65/15/2이므로 산형 소포로리피드는 아랫부분에 위치하게 된다. 그리고 H-NMR에서 lipid group의 끝부분에 붙어있는 CH3는 3.67에서 singlet이 나타나고 이중결합은 5.2∼5.4부근에 나타난다. 이것으로 methyl-SL이 합성되었음을 알 수 있었다[3].

Figure 1                               Figure 2

Figure 3                                Figure 4

Figure 5

참고문헌

[1] 김경준,중앙대학교 석사학위논문, Biosysthesis of Sophorolipids in a      Jar-Fermenter and Interfacial Properties of Acidic Sophorolipid,          (2000)

[2] J. F. T. Spencer et al, Structure and reactons of lactonic and         acidic sophorosides of 17-hydroxyoctadecanoic acid Canadian Journal      of Chemistry, 46, 3337 (1968)

[3] Kirpal S. Bisht et al, Enzyme-Mediated Regioselective Acylations of     Sophorolipids,  J. Org. Chem.  64, 780-789 (1999)

[4] Susumu Ito and Shigeo Inoue, Sophorolipids form Torulopsis             bombicola: Possible Relation to Alkane Uptake, Appl. Environ.           Microbiol. 1278-1283(1982)