Bacillus stearothermopilus L1에서 유래한

lipase의 emulsion 상에서 olive oil의 가수분해 특성 평가

박지현, 한준영, 최성용, 조영일, 안익성

연세대학교 화학공학과, 생물 환경공학 연구실

Studies on Hydrolysis of olive oil

in emulsion phase by lipase from Bacillus stearothermopilus L1

Ji Hyun Park, Jun Young Han, Sung Yong Choi, Young Il Joe, Ik Sung Ahn

Bio Environ. Engg. Lab., Yonsei Univ. Korea

서론

20세기 들어와서 지금까지 화학공업의 눈부신 발전은 모든 산업 발전에 획기적인 기여를 하였다. 하지만 지구환경 분야에서 여러 가지 문제점을 발생시킴으로써, 선진국에서는 생물학적 방법으로 화학공정 대체 및 자원에너지 절약 측면에서 제품개발과 적용 기술개발에 대한 연구를 활발히 진행하였다.

그 중에 기존의 화학적 유지 가수분해 공정은 여러 가지가 있지만, 가장 많이 이용되는 공정은 고온·고압 열분해법이다. 고온·고압 열분해법은 비교적 짧은 시간에 높은 가수 분해율을 얻을 수 있는 것이 장점이다. 하지만, 막대한 에너지 소비, 플랜트 건설 비용이 많이 든다는 경제적 이유등 여러 단점들을 가지고 있다 [1,2,3]. 따라서 이러한 단점들을 개선하기 위한 목적으로 리파제의 응용이 연구되기 시작하였다. 이러한 공업용 효소 중에서 lipase를 응용한 유지의 가수분해는 에너지 절약, 플랜트 건설 비용 절감, 생성 지방산 및 글리세롤의 품질향상이라는 장점을 가지고 있다. 하지만 효소 공정은 화학공정에 비해 긴 반응시간과 연속 공정의 어려움, 또한 고온에 효소가 쉽게 변성이 되며 격렬한 혼합에 의해 변성을 받기 쉽다는 단점을 가지고 있다.  또한 lipase 응용 연구에서 공통적으로 지적된 가장 큰 문제점은 리파제의 생산 단가가 높다는 것이다[4]. 따라서 유전자 재조합 기술을 이용한 Bacillus stearothermophilus L1에서 유래한 리파제 유전자는 내열성, 내알카리성 및 유지의 1,3-specific 기질 특이성을 갖고 있어서 유지 가수분해반응 시스템의 설계에서 유지로부터 특정부산물 만을 얻게 할 수 있는 장점이 있다.

본 연구에서는 Bacillus stearothemopilus lipase(BSL)의 유지 분해반응 특성을 조사하였고,  시판 lipase인 Candida rugosa lipase(CRL)을 통하여 비교하였다.

실험

lipase기질 용액을 만들기 위해 Sigma에서 구입한 0.5%(w/v) Gum arabic, 1mM CaCl2, 20mM NaCl를 포함하는 용액 495 ml에 5 ml olive oil(Sigma)을 첨가한 후, 2min동안 Warning blender을 사용함으로써 emulsify하였다. Enzyme assay를 위해 enzyme solution은 Bacillus stearothermophilus L1에서 유래한 lipase와 상용으로 이용되는 Candida rugosa lipase(Sigma)를 반응의 최적 pH를 결정하기 위하여 10 mM phosphate buffer를 이용하여 pH 8, 9, 10으로 제조하였다. 또한 가수분해 반응에서 최적 온도를 결정하기 위해서 반응 온도를 25℃, 37℃, 50℃로 결정하였으며, lipase의  preincubation time의 영향을 알아보기 위해서 시간을 0 min, 10 min, 30min으로 결정하였다. 718 pH-stat titration(Metrohm. Swiss)의 반응기에 유지 가수분해를 위해 기질 용액 35ml와 미리 결정한  각각의 반응 온도와 pH에서 lipase solution  35□를 첨가함으로써 반응을 진행하였다. lipase solution 첨가 후, 초기 10min동안 반응조건의 pH를 유지하기 위해 가입된 10mM NaOH의 양을 측정한 후 lipase의 activity를 계산하였다. 이때 효소의activity에서 1unit 정의는 1min 동안에 fatty acid를 1□mol 생성하는 enzyme의 양을 말한다.

결과 및 토론

1) BSL의 반응 조건에 따른 유지 가수분해의 활성도 변화 비교

최적온도와 pH에서 기질에 효소가 접촉하여 촉매작용을 해야 한다. 따라서 선행되어야 할 반응 조건으로 온도, pH, preincubation time을 변화 시켜 리파제의 활성변화를 조사하였다.

Fig. 1은 반응 시간을 10분으로 고정하여 activity를 측정한 결과이다. 실험 조건 중 30분 동안의 preincubation, 50℃, pH10에서 활성도는 51.942unit/ml·min으로 가장 높은 값을 보였으며 이를 기준으로 하여 모든 activity data는 백분율(%)로 나타내었다. 각각의 온도에서 pH가 증가함에 따라 효소의 activity는 증가하였고, 반응 pH 모두에서 반응온도 50℃일때 효소의 활성도가 가장 높았다. 각 온도별 preincubation의 영향은 Fig.1,2,3에 나와있다.

Fig.2,3의 좌측 부분에서 알 수 있듯이 5시간 정도의 preincubation(5시간 정도 효소가 고온에 노출)은 효소 활성에 큰 영향을 미치지 않았으나, Fig.3의 우측 부분에서 나와 있듯이 그 이상의incubation은 효소 활성의 감소를 가져왔다. 12시간 preincubation 후에는 초기 활성의 50%정도, 4일동안 incubation 하였을 때는 불과 20%정도 활성을 보였다. 이는 장시간 리파제를  (50℃)에서 유지 가수분해공정에 사용할 경우 효소활성의 감소로 반응속도가 떨어질 것을 예견하고 있다. 이런 효소활성의 열적 불안정성이 효소 응집에 의해 초래되었는지를 알아보기 위해 bile salt가 함유된 용액에서 리파제를 preincubation하였다. Fig.3에서 알 수 있듯이 preincubation time이 길어질수록 리파제의 활성이 감소하였다. 그러나 30시간 정도가 경과한 다음에는 효소 활성의 감소가 나타나지 않았다. 반면에 bile salt를 가입하지 않은 경우에는 효소 활성이 계속 감소하고 있었다. 한편 bile salt의 가입 시점을, 반응 시작전이 아니라 이미 효소 활성이 감소됨이 확인된 후 가입하였을 경우에는 효소 활성의 갑작스런 증가가 관찰되었다. 따라서, 생산 리파제의 열적 불안정성은 효소의 응집에 의해 발생하는 것으로 추측되나 확신하기 어렵다[5].

2) Substrate solution 내에서 Gum arabic의 영향

Fig. 4는 substrate의 안정성을 유지시키는 gum arabic의 영향에 대해 실험한 결과이다. 50℃, pH 10에서 10분간 preincubation 한 리파제를 이용하여 5시간 동안 유지 가수분해반응을 진행시켰을 때 , 반응시간이 경과함에 따라 activity가 점차 감소하는 것을 알 수 있다. 한편 gum arabic을 1/10 로 감소시키고, 동일 조건하에서 측정한 activity는 초기에 약 25%감소하였으나, 반응이 진행되면서 완만하게 감소하는 경향을 보인다. 이는 olive oil과 water의 emulsion의 안정성을 유지시키는 역할을 하는 gum arabic의 양이 감소함으로써 emulsion 의 안정성이 떨어져 기질을 불안정하게 하는 것으로 사료된다.

(A)                                    (B)

(C)

Fig. 1. Effect of temperature, pH, and preincubation time (up to 30 min) on Bicillus  stearothermophillus

lipase activity. Preincubation time : (A) 0min, (B) 10min, (C) 30min.

Fig. 2. Effect of temperature, pH, and preincubation time (up to 30 min) on Bicillus stearothermophillus

lipase activity. Preincubation time : (A) 0min, (B) 10min, (C) 30min.

Fig. 3. Effect of preincubation time upto 5 hours on Bacillus stearothermophillus lipase activity : 50℃,H10

(up to 30min) on Bicillus stearothermophillus

Fig.4. Effect of long time preincubation. Reaction condition: 50 ℃, pH 10.

3)BSL과 CRL의 비교

BSL에 비교하기 위해 상용으로 널리 이용되는 CRL을 사용하여 실험을 하였다. Fig.5는 CRL을 이용하여 BSL과 같은 조건에 온도, pH 그리고 0분에서 30분의 preincubation 시간을 반응 조건 변수로 하여 activity를 측정한 결과이다. CRL의 activity는 50℃, pH10,30min의 preincubation에서, 10.629unit/ml·min으로 가장 높은 활성도를 보였으며, 이를 기준으로 하여 activity data를 %로 나타내었다. 전체적인 경향은 BSL과 같으나, activity의 절대비교 하면 약 5배 이상의 활성도를 가지고 있다.

(A)                                         (B)

(C)

Fig.5 Effect of temperature, pH, and preincubation time (upto 30 min) on Candida rugosa lipase        activity. Prencubation time : (A) 0min, (B) 10min, (C) 30min

참고 문헌

1.Kodera, Y., H. Nishumura, A. Matsushima, M.Hiroto, and Y. Inada, Lipase Made     Active    in Hydrophobic Media by Coupling with Polyethylene Glycol, J. Am. Oil Chem. Soc., 71,      335-338 (1994).

2. Linfield, W. M.  Enzymatic fat splitting, J. Am. Oil Chem. Soc. 65, 131-132  (1998).

3. Park,Y.K.,G.M.Pastone, and M.Mitui de Almeida,hydrolysis of Soybean Oil by a               Combined Lipase System, J.Am.Oil Chem.Soc.,65,252-254 (1988).

4. 강성태, “ 리파제를 이용한 유지의 가수분해”, 식용 유지의 최근 연구동향 제9장, 한국 식품    과학회 (1992).

5 Emmanuel Lesuisse, Karin Shanck, Purification and preliminary characterization of            extracellular lipase of Bacillus sudtilis 168, an extremely basix pH-tolerant enzyme, Eur.      J.Biochem. 216,155 (1993).