PNGase F를 이용한 펩타이드의 in vitro glycosylation

박수진, 이지연, 박태현

서울대학교 응용화학부

In vitro glycosylation of peptide by PNGase F

Su Jin Park, Ji Youn Lee, Tai Hyun Park

School of Chemical Engineering, Seoul National University

서론

Glycosylation은 진핵세포의 소포체에서 일어나는 대표적인 번역후 과정(post translational modification) 중의 하나이다. 이런 glycosylation은 단백질의 구조와 기능에 변화를 가져옴으로써 결국 단백질의 활성에 큰 영향을 미치게 된다.  Glycosylation의 단백질의 구조에 미치는 영향에 대한 연구는 당펩타이드 모델을 통해서만이 가능하기 때문에 당펩타이드를 제조할수 있는 방법의 개발이 중요하다. 이런 당펩타이드를 효소를 이용하여 제조하는 방법은 기존의 유기화학적인 방법을 대체할 수 있으며 효소의 기질 특이성으로 인해 glycosylation을 선택적으로 할 수가 있다.

PNGase F (peptide:N-glycosidase from Flavobacterium meningoseptidum)는 endoglycosidase 중의 하나로서 asparagine과 올리고당의 안쪽부분에 위치한 N-acetyl glucosamime (GlcNAc) 사이의 결합을 끊는 효소이다. 비록 glycosidase로 분류되지만 실제로는 amide 결합을 가수분해하게 되며, 효소의 active site가 Asp-60, Glu-206, Glu-118인 것을 보면 carboxylic protease와 같은 메카니즘을 가짐을 유추할 수가 있다. 또한 PNGase F는 두 개의 GlcNAc를 가진 sugar chain과  양쪽 끝이 peptide bond로 연결된 Asn과의 결합만을 가수분해 할 수가 있다는 특이성이 있으며 glycopeptide를 -GlcNAc-NH2와 -Asp-로 자른다. 이후에 GlcNAc-NH2는 다시 GlcNAc와 NH3로 분해된다.

실험

본 실험에서는 당을 amination 시킨 후에 PNGase F를 이용하여 glycosylation을 수행하였다. 두 개의 GlcNAc로 구성된 chitobiosylamine(CHB)과 Arg-Lys-Asp- VaL-Tyr로 구성된 pentapepdide를 반응물로 사용하였고, ammonium bicarbonate (NH4HCO3)를 이용하여 CHB를 amination 시켰다. glycosylation 반응의 평형을 역으로 이동시키기 위해서 유기용매를 사용하였으며, TLC와 MALDI-TOF-MS를 이용하여 각각의 반응을 분석하였다. 유기용매는 PNGase F의 활성을 감소시키지 않는 것을 선택하기 위해서 RNase B를 deglycosylation 시키는 반응을 통해서 활성을 측정한다.

(1) 유기용매의 선택

1□g의 RNase B에 1%(w/v) SDS를 넣고 100℃에서 5분간 끓여서 RNase B를 denaturation시킨 후에 2 unit의 PNGase F를 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응용매는 10mM sodium phosphate aqueous buffer (2.5mM EDTA, pH 7.2)와 50% (volume ratio)의 유기용매로 구성되어 있으며, 유기용매로는 DMSO, 1,4-Dioxane, THF, ethylene glycol을 사용하였다. Deglycosylation의 정도를 알아보기 위해서 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 이용하여 glycoprotein과 당이 제거된 protein을 분리하였고, coomassie brilliant blue로 염색을 하였다. PNGase F는 1nmol의 dansyl fibrin glycopeptide를 37℃, pH 7.8에서 1분동안 끊을 수 있는 양으로 정의한다.

(2) CHB의 amination

1M의 CHB가 녹아있는 용액에 ammonium bicarbonate(NH4HCO3)를 첨가하여 NH4HCO3가 포화되게 한다. 그리고 나서 상온에서 10일간 보관을 하면 chitobiosylamine이 생성된다. 반응중에 NH4HCO3의 포화를 위해 약간의 NH4HCO3를 첨가해주며, 반응의 진행을 확인하기 위해서 TLC (ethyl acetate:acetic acid:methanol:water=4:3:3:2 in volume)를 이용하며 ninhydrin으로 염색을 한다. 반응후 남아있는 NH4HCO3를 제거해 주기 위해서 질량이 일정해 질때까지 동결건조를 반복해준다(6번~7번). chitobiosylamine의 양은 반응하고 남은 CHB의 양을 측정함으로써 간접적으로 정량화하며, 다른 농도의 CHB를 0.5□L씩 전개한 후에 Total Lab (phoretix, USA)이라는 프로그램으로 calibration curve를 그린다.

(3) PNGase F에 의한 pentapeptide의 glycosylation

20□L의 반응 용액에는 2mM의 pentapeptide, 200mM의 sugar solution, 50%의 유기용매, 3unit의 PNGase F가 들어 있으며 37℃에서 반응을 수행한다. PNGase F에 의한 glycosylation을 확신하기 위해서 PNGase F가 없는 반응을 독립적으로 수행을 하며 각각의 시간별로 1.5□L씩 샘플링하고 각각의 sample은 speed Vac으로 solvent를 제거한 후에 -70℃에 보관한다.

(4) MALDI-TOF-MS 분석

Time-of-flight mass spectra는 Voyager Biospectrometry workstation (linear 모드)을 이용하여 측정하였으며, 337nm의 질소 레이져를 이용하여 탈착을 하고 1.2 m 비행 튜브를 이용하여 시간을 측정한다. 30kV 가속전압과 64번의 측정으로 평균값을 구한다. 반응하지 않은 pentapeptide(MW:679.8)를 이용하여 calibration한다.

각 샘플튜브에 0.1% trifluoroacetic acid가 포함된  50% acetonitrile 수용액 5□L를 넣고 잘 녹인후에 1□L를 취하여 3□L의 매트릭스 용액과 섞는다. 그 후에 1□L 의 sample을 gold plate에 놓고 낮은 압력에서 건조시킨다. 매트릭스 용액은 위에서 사용한 용액 1mL에 10mg의 □-cyano-4-hydroxycinnamic acid를 넣어서 만든다.

결과 및 토론

(1) 유기 용매의 선택

50%의 유기용매에서 PNGase F의 활성을 측정한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 실험결과를 보면 물과 섞이는 용매들 중에서는 log P값이 클수록 PNGase F의 값에 적게 영향을 미친다는 것을 알 수가 있었다. 이 결과는 용매가 물과 잘 섞이게 되면 PNGase F의 표면에 붙어있는 물분자들을 떨어뜨려서 물과 PNGase F의 수소 결합에 의한 PNGase F의 active site의 유연성을 줄여서 활성을 감소시킨다는 사실로 설명할 수가 있으며, 반면에 ethylene glycol의 경우는 비록 물과 잘 섞이긴 하지만 물을 대신하여 수소결합을 할 수 있는 hydroxy 기가 2개이므로 PNGase F의 activity를 많이 감소시키지 않는다는 사실을 알 수 있다. 결국 PNGase F의 역반응을 유도시킬 유기용매로는 ethylene glycol이 가장 적당하다.

<Fig. 1> Deglycosylation of RNase B by PNGase F in various solvents. Lane 1: marker, Lane 2: RNase B (control), 3: 100% water, 4: 50% DMSO, 5: 50% 1,4-dioxane, lane 6: 50% THF, lane 7: 50% ethylene glycol

(2) CHB의 amination

TLC 분석결과 CHB와 chitobiosylamine의 Rf값은 각각 0.49, 0.38이었으며 CHB의 양을 측정하기 위해서 calibration 곡선을 그리면 Fig. 2와 같다.

<Fig. 2> calibration curve for the concentration of CHB

이 곡선을 통해서 CHB의 amination은 90%정도 진행되었음을 알 수 있다.

(3) glycosylation 및 MALDI-TOF-MS 분석

glycosylation 반응 후 질량분석을 하였으며, 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 실험 결과 pentapeptide (MW: 679.8)에 chitobiosylamine (MW: 424.4)이 물이 빠지면서 결합하여 glycopeptide (MW: 1086.2)가 생성되었음을 알 수 있었다. 또한 PNGase F가 없을 때에도 glycosylation이 일어남을 볼 수가 있는데(data not shown), 이는 CHB가 Lys의 아민기에 붙어서 생성이 된 것이다. 그러나 PNGase F가 첨가되었을 경우에 glycopeptide의 상대적인 intensity가 상당히 높음을 보았을 때, PNGase F가 chitobiosylamine이 펩타이드의 Asp에 결합했음을 생각할 수가 있다.

<Fig. 3> MALDI-TOF-MS analysis of glycopeptide (2hr reactions).

참고문헌

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