크로마토그래피를 이용한 라세미 케토프로펜의

광학분할에 관한 연구

김소영, 서성섭, 최민호, 박달근*, 이중기*

한국과학기술연구원 청정기술 센터*, 홍익대학교 화학공학과

A study on optical separation of Ketoprofen racemate by chromatography

So-Young Kim, Sung-Sup Suh ,Min-Ho Choi,

DalKeun Park*, Joong Kee Lee*

Clean Technology Reserch Center,  KIST*,

Department of Chemcal Engineering, Hongik University

서론

한 쌍의 광학 이성질체로 존재하는 키랄 의약품에 있어서 두 광학 이성질체는 생체내에서 서로 다른 물리적·화학적 성질을 나타낸다. 따라서 인체내의 다른 약리활성은 아주 중요하다. 종종 한 쌍의 광학 이성질체 중 단지 하나의 광학 이성질체만이 약리활성을 나타내며 다른 광학 이성질체는 아무런 약리활성을 나타내지 않거나 혹은 독성을 갖고 있는 경우가 많이 보고되고 있다.

그래서 전세계 여러 나라의 의약품 산업에서 요구되는 것은 효과는 최대이면서 부작용은 최소인 의약품을 개발하고 상품화하는 것이다. 이러한 과정에서 필수적으로 요구되는 것은 키랄 의약품을 단일 이성질체의 키랄 약품으로 생산하는 것이며 이에 관한 많은 연구 개발이 선진국에서 진행 중에 있다[1]. 의약품 생산에 있어서는 원하는 순수한 성질의 물질만을 얻는 것이 대단히 중요하기 때문에 키랄 의약품을 고순도로 분리 및 정제하는 것이 더욱 필요해지고 있다.

단일 이성질체의 키랄 약품 개발 방향은 새로운 합성방법 개발과 기존 라세미 혼합물을 분리하는 방법이 있으나, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 단일 이성질체 분리기술은 asymmetric 합성방법과 같은 새로운 합성방법에 비해 시간과 개발비를 크게 줄일 수 있는 장점이 있다[2].

본 연구의 실험대상인 Ketoprofen[(R,S)-2-(3'-benzoylphenyl)propionic acid]는  비스테로이드 계열의 진통 및 소염제(NSAID)로서 현재 라세미혼합물로서 이용되고 있다. 이 의약품은 류마티즘, 관절염등의 진통제나 해열제로 여러 가지 용도의 치료약으로 널리 이용되고 있다. 그러나 Ketoprofen은 치료약으로 사용될 때에 S-(+)-Ketoprofen이 주로 약물학적 효과를 나타내고 R-(+)-Ketoprofen은 불활성이거나 약리 활성을 줄이는 문제점이 있다[3].

본 연구에서 수행한 실험에서는 라세미혼합물 상태인 Ketoprofen을 분리하기 위하여 분리하고자 하는 Ketoprofen의 분자식에 근거하여 선택된 키랄 분리용 고정상 물질을 사용한 칼럼을 가지고 이동상의 조성비, 이동상의 유량, 시료의 종류와 농도에 따른 분리도, 이론단수, 분리인자의 변화 경향을 실험하였다. 또 분리도에 미치는 인자를 조절하면서 라세미 Ketoprofen의 분리도를 높일 수 있는 실험조건을 조사하였다.

실험

본 실험에 사용된 HPLC의 칼럼은 Kromasil□충진제(Eka chem . ,Sweden)를  내경이 4.6mm, 길이가 250mm인 stainless-steel 칼럼(Alltech)에 슬러리 팩킹하여 사용하였다. Kromasil□에 사용된 슬러리 용매는 methanol/acetone[50/50,v/v%]혼합물이었고 가압 용매로는 methanol을 사용하였다.

실험에 사용한 이동상 용매는 hexanes [95% n-hexane], tert-butyl methyl ether

[99.8%,HPLC grade, Aldrich Chmical Co.], acetic acid를 사용하였다. 실험에 사용된 시료 라세미 Ketoprofen은 삼일제약에서 제공받은 것을 사용하였다.

실험에서 사용한 실험장치는 고압펌프 (Young-Lin M930), injection system (syringe+sample loop), gradient mixer (Waters), UV spectrometer (Young-Lin M720), data aquisition (Young-Lin, Autochrowin)로 나눌수 있다. 이동상의 흐름을 조절하기 위해 HPLC 펌프를 사용하여 이동상의 흐름을 1.0∼5.0ml/min까지 변화시키면서 실험하였다. 시료의 주입은 0.05ml 주사기를 사용하고 샘플루프는 10□를 사용하여 주입부피를 조절해주었다. 이동상에서는 hexane/ tert-butyl methyl ether/ acetic acid의 조성비를 100/0/0.1, 70/30/0.1, 60/40/0.1, 50/50/0.1, 40/60/0.1, 0/100/0.1 (v/v%)로 변화를 주면서 적절한 이동상의 조성비를 찾는 실험을 하였고 주입시료의 solvent가 분리도에 미치는 영향을 확인하기 위해 solvent의 종류와 주입시료의 농도를 바꿔가면서 실험을 하였다.

유출되는 성분은 UV detector의 adsorbance값을 260nm에서 검출한 뒤 데이터 모듈에 연결시켜서 모듈에서 PC로 데이터를 전달하여 peak의 면적과 높이, retention time 등을 얻을 수 있었다.

분리도(R), capacity factor(K'), 이론단수(N)는 다음과 같은 식에 의해서 측정하였다.

[eqn: R~=~{t sub{2}~-~t sub{1}} over {{(w sub{2}~+~w sub{1})}/2}~=~{2△t} over {w sub{2}~+~w sub{1}}]                               ( 1 )

t1, t2는 시료 1, 2의 체류시간이며, w1, w2은 시간단위로서 peak 1, 2의 기준선에서의 폭이다.

[eqn: K'= { t_R- t_0} over {t_0 }]                                                          ( 2 )

tR은 용질의 체류시간, t0는 고정상과 상호작용이 없는 물질의 체류시간(dead time)이다. 칼럼의 효율은 baseline에서 측정한 peak의 폭(w)을 이용한 다음 식에 의해서 측정하였다.

[eqn: N = 16 LEFT ( { { t_R} over {w } }RIGHT ) ^{2 }]                                                         ( 3 )

결과 및 고찰

라세미 Ketoprofen의 분리를 위해 Kromasil□ 컬럼에서 시료의 주입농도는 100ppm, 주입부피는 10□, 이동상 유속의 범위는 1.0∼3.0ml/min으로 변화를 주었다. 이동상의 성분으로는 hexane/tert-butyl methyl ether/acetic acid을 사용하였다. 이동상의 조성비가 분리에 미치는 영향을 구체적으로 파악하기 위해서 이동상 내의 hexane/tert-butyl methyl ether/acetic acid의 조성비를 100/0/0.1, 70/30/0.1, 60/40/0.1, 50/50/0.1, 40/60/0.1, 0/100/0.1 (v/v%)로 변화를 주면서

Fig 1. Effects of mobile phase

composition and flow rate on

retention time of S-(+)-Ketoprofen.

Injection concentration of 100ppm

in hexane, injection volume of 10□.

Fig 2. Effects of mobile phase

composition and flow rate on

retention time of R-(+)-Ketoprofen.

Injection concentration of 100ppm

in hexane, injection volume of 10□.

실험하였다. 그 결과 Fig1, Fig2 및 Fig3을 비교해 보면 이동상 속에서 hexane의 양이 많으면 분리도가 증가했고 retention time은 길어졌다. 반면에 tert-butyl methyl ether의 양이 많아지면 분리도가 감소하고 retention time이 짧아지는 것을 확인할 수 있었다. Fig 4에서 S-(+)-Ketoprofen, R-(-)-Ketoprofen 두 물질이 분리되는 크로마토그램이 보여지는데 60/40/0.1의 조성에서 분리가 잘 이루어짐을 알 수 있다.

이러한 실험 결과로부터 분리도와 분리시간 모두를 고려할 때 적절한 이동상

Fig 3. Effects of mobile phase

composition and flow rate on

resolution.

Injection concentration of 100ppm

in hexane, injection volume of 10□.

Fig 4. Chromatogram of S-(+)-Ketoprofen       R-(-)-Ketoprofen from in Kromasil□       column at various mobile phase         compositions.

Fig 5. Effects of feed solvent on

retention time of S-(+)-Ketoprofen,

R-(-)-Ketoprofen.

Injection volume of 10□.

Fig 6. Effects of feed solvent on

resolution. Injection volume of 10□.

의 조성비는 hexane/tert-butyl methyl ether/acetic acid의 부피비가 60/40/0.1 (v/v%)일 때 적절할 것으로 추정할 수 있으나 최적의 분리조건을 찾기 위해 추가의 연구가 필요하다.

Kromasil□ 컬럼을 이용하여 주입부피는 10□으로 고정하고 hexane내에 분석시료의 주입농도를 100ppm, 90ppm, 80ppm, 70ppm, 60ppm으로 분석시료의 농도를 감소시키면서 크로마토그램의 변화를 관찰하였다. 그 결과 분석시료의 농도가 분리도에 크게 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있었다. 하지만 이 실험을 통해서 알 수 있었던 중요한 사실은 분석시료로 사용했던 hexane내에 Ketoprofen이 100ppm이상 잘 용해되지 않는다는 점이었다. 그래서 이번에는 분석시료의 용매를 hexane, tert-butyl methyl ether, acetic acid를 혼합하지 않고 순수한 물질로서 각각 사용하여 실험하였다. Acetic acid의 경우는 Ketoprofen이 아주 잘 용해되었지만 분리가 되지 않았다. Fig 5과 Fig 6에 보이듯이 hexane과 tert-butyl methyl ether의 경우에는 두 물질의 분리도 및 retention time은 비슷하였다. 그러나 tert-butyl methyl ether가 Ketoprofen이 아주 잘 용해시킨다는 장점을 보였기 때문에 생산성 측면에서 유리하다고 볼 수 있다. 그러나 최종 상업화를 할 때 어느 물질을 분석시료로 사용했을때 더 유리 할지는 가격이나 용매 재회수, 인체 유해도, 기술적 용이 등을 고려해야 하므로 아직까지는 정확히 알 수 없었다.

참고문헌

[1] 현명호, □LC에 의한 광학 이성질체의 분리□ , Chapter 2(1996)

[2] Yoshio, o., Ryo, A., Kazuhiro, H. and Koichi, H.: J. of Chromatography B.:     53, 701, (1997)

[3] W.J. Wechter, J. Clin. Pharmacol. 38 (1998) 1S-2S.