Supercritical AntiSolvent (SAS)법을 이용한 단백질 미세입자 제조

송규호, 이정우, 임종성, 이윤용, 이창하*, 이윤우

한국과학기술연구원, 국가지정 초임계유체연구실

연세대학교, 화학공학과*

The Preparation of Protein Microparticles

Using Supercritical AntiSovent (SAS) Method

Kyu Ho Song, Jeong Woo Lee, Jong Sung Lim, Youn Yong Lee,

Chang-Ha Lee*, Youn-Woo Lee

Supercritical Fluid Research Lab., Korea Institute of Science and Technology

Chemical Engineering Department, Yonsei University*

서 론

거대한 globular proteins (e.g., bovine serum albumin; BSA)을 포함한 어떠한 크기를 가진 분자들이 생체적합한 고분자로부터 연속적으로 서서히 전달되어질 수 있다는 보고가 나온지 얼마되지 않아 단백질과 펩타이드의 제어형 방출 시스템 분야가 급속히 발전하였다. 단백질과 펩타이드에 대한 제어형 방출 시스템은 기존의 용액 제형에 비해 상당한 장점을 가지고 있다 [1]. 이러한 장점으로는 투여 주기의 감소, 생체내에서의 약물 level의 peak(마루)와 trough(골)의 최소화와 만성 질환자의 간편성, 부여할 단백질 복용량의 감소 등을 포함하고 있다. 대부분의 제어형 방출 시스템은 현재 주사제과 이식제용으로 쓰이기 위한 단백질과 펩타이드의 연구가 진행 중에 있다.

특히, 약물전달시스템에서는 마이크로 그리고 나노 크기의 입자들에 대한 관심이 집중됨에 따라 그러한 물질들을 제조하기 위한 전통적 기술과 현재의 기술들이 종종 접목되어지는 것으로 인식되고 있다. 예를 들어, 높은 에너지를 필요로 하는 분쇄법은 비효율적이며 상당한 전하를 띈 생성물을 형성시킬 뿐만 아니라 표면과 결정 구조에 손상을 일으킨다 [2]. 회분식의 변형과 downstream 공정의 어려움 등의 예상된 안정성상의 문제점을 유발한다. 미세입자들이 직접적으로 약물 용액으로부터 생성되어질 수 있는 단일 단계의 초임계 유체 공정은 대체 방법으로 매력을 가지고 있다. Rapid Expansion of Supercritical Solutions (RESS) 공정은 마이크로 크기의 입자들을 생성할 수 있는 것으로 보여져 왔다. 하지만, 노즐의 막힘 현상과 초임계 유체 내에서 물질의 안정성 제한을 가지고 있기 때문에 여러 분야의 물질로의 응용에 있어서 그러한 공정은 다소 한정된다. 반면, Supercritical AntiSolvent (SAS) 공정은 생분해성 고분자, 의료제, 그리고 반도체 등의 넓은 범위에서 마이크로 그리고 나노 크기의 입자를 성공적으로 제조하여 사용되어져 왔다. 또한, SFCO2내에서의 물의 용해도는 연구가들로 하여금 단백질과 같은 생체학적 물질들을 위한 비수용성 매체로서 dimethylformaide (DMFA)와 dimethylsulfoxide (DMSO)를 포함한 유기용매를 사용하도록 한다. 그러한 용매들은 단백질이 이러한 용매내에서 낮은 용해도와 2차, 3차 단백질 구조의 잠재적 손실을 나태내기 때문에 제한성을 가지고 있다. 그럼에도 불구하고 비록 상당한 섭동이 DMSO 용액내에서 증명되었으며, 고체 단백질 입자들 내에서 부분적으로 존재할지라도 SAS 공정에 의해 제조된 insulin, lysozyme과 trypsin의 마이크로 크기의 입자들은 재편성되어 생태학적 활동성이 회복되는 것으로 보고되고 있다.

모든 기체들은 비록 매우 높은 온도/압력이 필요할지라도 특정 임계 조건보다 높은 범위에서 초임계 유체를 형성할 수 있다. 일정한 Tc와 Pc를 가진 여러 초임계 유체들은 다양한 산업 분야에서 입자 생성을 위해 사용되어져 왔다. 특히, 생분해성 고분자와 약물 등의 의료 산업으로의 응용에 있어서 가장 널리 이용되고 있는 초임계 유체는 비가연성, 무독성, 저렴할 뿐만 아니라, 낮은 임계 온도 (31.1℃)를 가지고 있어 열에 민감한 물질들에 대해서 매우 매력을 가진 이산화탄소(SFCO2)이다.

본 연구의 목적은 약물전달시스템에 사용될 단백질 중에서 lysozyme과 bovine serum albumin (BSA)의 미세입자 생성 여부와 공정 변수에 따른 입자 크기와 크기분포 및 형태의 제어 가능성을 연구함으로서, 생분해성 고분자로부터 약물을 encapsulation할 경우 초기에 생성될 단백질의 크기를 제어함으로서 encapsulation된 약물의 방출 제어시 입자 크기 및 크기 분포와 형태에 따른 방출 속도의 제어 가능성과 영향을 알아보는 데 있어 기초 자료를 구축하는 데 있다.

실험 방법

SAS 공정을 통해 재결정화시킬 목적으로 구입한 단백질은 lysozyme (chicken egg white, 3x crystallized, dialyzed and lyophilized)과 bovine serum albumin (BSA) (fraction V, minimum 98% (elextrophoresis))로서 둘 다 SIGMA에서 구입하였다. 이산화탄소는 99.0%의 순도로서 신양산소에서 구입하였으며, 용매로서는 dimethylsulfoxid (DMSO) (A.C.S reagent, 99.9%, Aldrich), methanol (HPLC solvent, J. T. Baker)와 초순수 증류수 (HPLC reagent, J. T. Baker)를 사용하였다.

초임계 SAS법을 이용한 단백질 재결정화에 이용한 실험장치는 자체적으로 설계 제작되었으며, 장치 도면 및 실험 과정은 이미 언급한 문헌과 동일하다 [3].

결과 및 고찰

Lysozyme

Fig. 1은 lysozyme 원시료와 DMSO 용액으로부터 SAS 재결정법에 의해 제조된 입자들의 SEM 사진이다. Fig. 1에서 보는 것과 같이 SAS 공정에 의해 재결정화된 lysozyme 입자들은 원시료와 비교해서 전혀 응집 현상도 일어나지 않았으며, 원시료의 입자 크기가 50-100□ 정도의 비교적 넓은 크기분포를 가지고 있는 데 반해서 1□이내의 매우 미세한 입자들이 생성되었다. 또한, 입자의 형태에 있어서도 원시료와 뚜렷한 차이를 보임을 알 수 있다. 초기 원시료의 형태가 판형태의 일정한 크기를 가지고 있지 않는 데 반해서 SAS 공정에 의해 제조된 lysozyme 미세입자들은 구형의 매우 좁은 입자크기분포를 가지고 있다.

노즐의 위치를 결정하기 위해 일정한 온도와 압력 (35℃, 100bar), 노즐 직경 0.01", 그리고 농도 0.2wt%에서 노즐을 precipitator내의 상부와 하부에 각각 위치 시켜서 실험을 하였다. 노즐을 precipitator내의 상부에 위치시켰을 경우 (Fig. 1 (b))에는 생성된 lysozyme 입자들이 0.2-0.4□의 입자크기와 비교적 좁은 입자크기분포를 가지고 있지만, 입자들 사이의 다소의 응집 현상이 일어남을 볼 수 있다. 반면, 노즐을 precipitator내의 하부에 위치시켰을 경우 (Fig. 1 (c))에는 SAS 공정에 의해 생성된 lysozyme 입자들은 0.03-0.15□로서 노즐을 상부에 위치시켰을 때보다 훨씬 더 작은 입자크기를 보였다. 하지만, 두 실험에서 모두 생성된 lysozyme 입자들 사이에 다소의 응집현상이 일어나는 것을 알 수 있다. 이는 lysozyme의 초기 농도가 비교적 높아서 노즐에서 lysozyme을 포함한 용액이 노즐을 통해 분사되어 lysozyme 입자들이 재결정될 때 순간적으로 많은 nuclei가 생성되어 입자들 사이에 다소의 응집현상이 일어나는 것으로 사료된다.

Bovine Serum Albumin (BSA)

BSA는 매우 친수성의 성질을 가지고 있어서 일반 유기 용매에는 용해되지 않는다. 따라서, SAS 공정을 수행하는 데 있어서 precipitator내에서 antisolvent로 사용되는 CO2와 적절한 공정 조건하에서 매우 잘 용해되는 유기 용매가 필요하다. BSA는 친수성을 성질을 가지고 있으므로 용매로서 물을 사용할 수 있지만, 일정한 온도와 압력 (일반적으로, 초임계 또는 아임계)의 공정 조건하에서는 CO2와 물의 용해도가 매우 낮으며 SAS 공정 후에 재결정화된 BSA 입자내에 남아 있는 물을 초임계 또는 아임계의 CO2로서 완전히 건조시킬 수 없다. 또한, 이러한 BSA 입자들 (미량의 물이 남아 있을 경우)은 enzymatic activity에 다소의 문제를 가지고 있음을 Tom. et. al.은 보고하고 있다 [4].

따라서, 본 실험에서는 BSA 원시료를 매우 미량 (<5wt%/wt (DW+DMSO))의 초순수 증류수에 용해시킨 후 DMSO 또는 methnol을 사용하여 일정한 농도(0.1wt%)를 유지시켰다. Fig. 2는 35℃에서 압력의 변화 (80, 100, 그리고 150bar)에 따라 생성된 BSA 미세입자의 SEM 사진들이다. Fig. 2에서 보는 것과 같이 100bar와 150bar에서 생성된 BSA 미세입자들은 0.06-0.1□ 크기의 매우 작은 입자크기와 좁은 입자크기분포를 가지고 생성되었다. 또한, 어떠한 응집현상도 일어나지 않은 구형의 미세입자들이 얻어졌다. 반면, 80bar의 비교적 낮은 압력하에서는 생성된 BSA의 미세입자들 사이에 응집현상이 강하게 일어남을 볼 수 있으나, 이러한 SAS 공정에 의해 생성된 BSA 미세입자들 사이에 bridge를 구성하고 있는 초기에 생성된 것으로 보이는 입자의 크기는 다른 압력 (100bar, 150bar)에서 얻어진 입자 크기와 비슷함을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 35℃의 일정한 온도하에서는 어떠한 압력하에서도 초기에 노즐에서 분사된 BSA를 포함한 용액이 CO2와 DMSO 용매사이의 물질전달에 의해 BSA가 개별적으로 입자로 형성되지만 35℃, 80bar에서는 DMSO의 비교적 낮은 volumetric expansion에 의해 생성된 입자들 사이에 bridge가 생성되는 반면, 100bar이상의 압력하에서는 DMSO의 높은 volumetric expansion으로 인해서 생성된 입자들이 쉽게 개별적으로 분리될 수 있어 어떠한 응집현상도 관찰되지 않음을 알 수 있다 [5].

감사의 글

본 연구는 산업자원부의 청정생산기술사업에 의해 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

참고 문헌

[1] Langer, R. S. New methods of drug delivery. Science 249, 1527-1533 (1990)

[2] Ward, G. H. and Shultz, R. Pharm. Res. 12, 773-779 (1995)

[3} Kyu Ho Song, Jong Sung Lim, Youn Yong Lee, Chang-Ha Lee, and Youn-Woo Lee, Theories and Applications of Chem. Eng. 6(2), 3245-3248 (2000)

[4} Tom, J. W., Debenedetti, P. G., Biotechnol. Prog. 7, 403 (1991)

[5] Kordikowski, A., Schenk, A. P., Van Nielen, R. M., and Peters, C. J., J. Supercri. Flu. 8, 205-216 (1995)

(a)                      (b)                     (c)

Figure 1. SEM photomicrographs of lysozyme unprocessed and particles precipitated with the SAS process: (a) untreated lysozyme (b) lysozyme prepared when the nozzle is located up in the precipitator (c) lysozyme prepared when hte nozzle is located down in the precipitator.

80bar                  100bar                  150bar

Figure 2. SEM photomicrographs of BSA micropartices precipitated at the different pressure with the SAS process. (T=35℃, C=0.1wt%/wt  (BSA+methanol+water), nozzle diameter=0.01")