초임계 유체를 이용한 Phaffia. rhodozyma로부터 Astaxanthin의 추출

이상윤(1), 이상준(2), 임교빈(2),

김현국(3),이은규(3), 조현옥(4), 남은경(4), 황규철(4),

연세대학교 화학공학과(1), 수원대학교 화학공학과(2),

한양대학교 화학공학과(3), (주)씨에스이엔지(4)

The Extraction of Astaxnathin

from Phaffia. rhodozyma by Supercritical Fluid

Sang-Yun Lee(1), Sang-Joon Lee(2), Gio-Bin Lim(2),

Houn-Kuk Kim(3), Enn-Kyu Lee(3),

Hyun-Ok Jo(4), Enn-Kyung Nam(4), Gyu-Cheol Hwang(4)

Dept. of Chem. Eng., Yonsei Univ.(1), Dept. of Chem. Eng., The Univ. of Suwon(2),

Dept. of Chem. Eng., Hanyang Univ.(3), C. S. Eng.(4)

서   론

Carotenoid 계통의 색소인 astaxanthin은 면역기능과 항산화력 등의 기능성을 지니는 물질로 어류양식의 사료에 첨가제로 많이 사용되는 물질이다. 이러한, astaxanthin을 대량으로 얻기 위해 화학적인 합성법을 이용하는 방법이 있으나[1] 낮은 생체 흡수율과 생체내 안전성 때문에 천연성 물질에 대한 수요가 증가되고 있는 실정이며[2] 게, 새우 등 갑각류의 껍질이나 조류(algae)등으로부터 유기용매 등을 사용하여 천연물질을 직접 추출하는 방법은 최종물질의 품질과 경제성 및 다량의 독성 유기용매 사용에 따른 고부가가치 상품으로의 실용화에 문제점이 존재한다. 더욱이 유기용매를 이용하여 추출 할 경우 추출 후 astaxanthin 이외의 여러 물질이 동시에 추출되어 추출 후의 불순물의 제거와 사용되어진 독성 잔류 유기용매의 완전한 제거가 어려워 식품첨가제나 의약품 소재로의 적용에 안전성 문제와 유기용매의 재사용 및 배출 등의 환경문제가 대두된다.

본 연구에서는 유기용매를 이용한 추출법의 문제점을 극복하기 위한 하나의 방법으로 초임계유체 추출공정을 이용하여 P. rhodozyma 세포로부터 astaxanthin을 추출하기 위한 연구를 수행하여 각 변수에 따른 추출경향을 검토하였다. 적색효모인 Phaffia rhodozyma는 astaxnathin을 생체내에서 합성하여 약 4000ppm정도의 높은 농도로 축적되고, 풍부한 단백질과 색소흡수를 촉진하는 불포화지방산, 비타민과 독특한 풍미를 가지고 있어서 색소원 뿐만 아니라 동물생육에 필수적인 영양공급원으로 이용가치가 높으며, 다양한 탄소원을 기질로 이용할 수 있고, 조류나 곰팡이에 비하여 배양하기가 쉽기 때문에 산업적인 대량생산이 용이하다는 장점이 있다.[3]

재료 및 실험방법

본 연구에서 사용되어진 P. rhodozyma는 (주)제일화학에서 배양되어진 것으로 초임계 유체 추출공정에의 적용을 하기 위하여 세포의 파쇄 및 건조가 되었다. 세포 파쇄는 고압분쇄기(French Press)와 bead milling 방법을 이용하여 두 공정의 파쇄 효율정도를 비교해 공정의 간편성과 처리용량의 한계점 등을 고려하여 bead milling 방법을 선정하였다. 파쇄에 사용되어진 기기는 대전의 생명공학연구소에 소장되어 있는 Dyno Mill (TYP KDL-PILOT, ISO9001 centrified)이며 0.25mm의 bead를 25%의 농도를 지니는 세포 분산용액과 함께 6000rpm으로 회전시키며 분쇄하였다. 파쇄 되어진 세포는 disk-type의 pilot용 분무건조기(spray dryer)를 이용하여 건조되어 사용되었다.

Astaxanthin의 추출을 위한 초임계 추출장치는 두개의 고압 정량 펌프와 추출기로 구성된 ISCO사의 SFX3560을 사용하여 순수한 이산화탄소만을 사용한 경우와 추출력 향상을 위한 조용매을 첨가하는 경우 등에 대하여 조작 변수에 따른 추출경향을 살펴보았다. 추출용매로 선택되어진 용매는 초임계 유체 추출공정에서 널리 사용되는 이산화탄소를 선정하였으며 99.99%의 순도를 지니고 있다.  astaxanthin과 carotenoid의 분석을 위한 표준물질과 보조용매로 사용되어진 HPLC급의 유기용매는 Sigma-Aldrich사의 것을 사용하였다.

추출물중의 carotenoid와 astaxanthin의 함량 비교는 유기용매를 사용한 추출결과에 대비하여 초임계유체 추출공정의 추출결과물을 UV와 HPLC를 이용하여 분석되었다.

결과 및 토론

P. rhodozyma 내의 astaxathin의 용이한 추출을 위한 세포 파쇄는 French press와 Bead milling의 두 방법을 수행하여 비교하였다. 비교 결과 Bead mill을 이용한 세포파쇄 방법이 French press를 이용하여 파쇄한 시료와 비교한 결과 동일하거나 더 우수한 파쇄 결과를 확인하였으며 공정의 scale-up 면에서도 장점을 지니기에 파쇄공정으로 선정하였다. 파쇄 되어진 효모는 nozzle-type pilot용 분사건기를 사용하여 건조되어 2wt%이내의 수분함량을 유지하여 초임계 유체 추출공정에 사용되었다. 분무건조기를 통하여 얻어진 건조 효모시료의 수율은 약 80%이상이었으며 건조 공정에서 발생된 astaxanthin의 손실은 약 20% 정도였다.

이산화탄소를 초임계유체로 사용한 초임계 유체 추출공정은 온도범위 40∼120℃, 압력범위 200∼600bar에서 수행되었으며 각 온도, 압력 조건에서의 추출 경향과 시간에 따른 추출 경향을 관찰하였다. 추출 결과 40℃ 와 80℃의 온도와 400∼600bar의 압력 범위에서 우수한 carotenoid 와 astaxanthin의 추출량을 보였으며(Fig. 1) 추출물 중 astaxanthin의 함유량은 일정온도에서 압력이 증가함에 따라 증가되고 있으며 동일한 이산화탄소의 밀도 상태에서도 온도가 증가됨에 따라 증가되는 것을 알 수 있었다.

또한, 40℃의 추출 온도 조건에 비하여 80℃ 조건과 파쇄 입자의 크기분포 범위가 작을수록 astaxanthin의 추출이 더욱 빠르게 이루어 졌다. 이러한 현상은 P. rhodozyma의 내부 및 세포벽 조직 사이에 존재 할 것으로 추정되는 astaxanthin의 추출을 위해서는 1차적으로 astaxanthin을 세포 조직으로부터 탈착 시킬 수 있는 열적 에너지와 초임계 이산화탄소의 물질전달의 효율을 증대시킬 수 있는 조건의 차이에 기인 한 것으로 추정된다. 파쇄 효모의 입자 크기에 대한 추출 경향은 53∼63□ 범위의 파쇄 효모와 600□ 이상의 크기를 지니는 파쇄효모의 시간에 따른 추출량 검토를 통하여 파쇄입자의 크기가 작을수록 매우 빠른 추출특성을 보임을 확인하였다.

초임계 유체 추출공정을 통하여 얻어진 추출물은 다음의 표와 Fig. 1에서 제시된 것처럼 유기용매를 이용한 추출물에 비하여 약 80%의 astaxanthin과 90% 이상의 carotenoid를 얻을 수 있었다.

	유기용매 추출		초임계 유체추출
	파쇄시료	spray dry	추출결과	유기용매 추출법 대비 (%)※
Carotenoid (mg/g-yeast)	1.227	1.017	0.057∼0.936	5.6∼92
Astaxanthin (mg/g-yeast)	1.013	0.772	0.078∼0.602	10∼78

※ 유기용매추출법 대비 (%) : Bead mill 파쇄 및 spray dry 후 시료 기준

Astaxanthin을 식품첨가제 및 의약품소재로서 응용범위를 확대하기 위해서 색소류의 주요 지질성분으로 알려진 유리지방산 및 트리글리세리드의 효율적 제거를 위한 정제공정이 요구된다. 이러한, 정제 공정의 기초적인 검토작업으로  실리카겔 칼럼을 이용한 분리법을 검토하였다. 실리카겔 칼럼의 분리능이 최적인 용제를 검토하기 위하여 8가지 용매조성별로 TLC로 분석하였으며 사용되어진 용제중 분리능이 최적인 Buffer는 hexane 과 acetone의 혼합물이었다.(Fig. 2) 그러나, 이와 같은 유기용매들은 비교적 강한 독성을 지니고 있어 향후 고순도의 물질 물리를 위한 실제 정제 공정의 적용에는 문제점을 존재한다. 따라서, 독성이 적거나 무독성의 용매의 지속적인 검토와 다른 정밀 분리 방법도 병행하여 검토 할 예정이다.

결론 및 향후 연구방향

본 연구에서는 P. rhodozyma로 부터의 astaxnathin의 초임계 추출공정 및 제품화를 위한 기초 연구가 수행되었다. 본 연구를 통하여 Astaxanthin의 위한 기존의 복잡한 유기용매 추출법에 비하여 초임계 유체 추출공정이 비교적 간단하며 추출되어지는 물질 중 astaxanthin이외의 물질 일부를 추출 공정상에서 감소시켜 상대적으로 최종 제품 중의 astaxanthin 함량을 농축시킬 수 있는 가능성을 확인하였다. 이런 결과를 토대로 향후 연구에서는 P. rhodozyma로 부터의 astaxnathin의 추출공정의 최적조건의 확립과 scale-up을 위한 자료의 확보를 위한 실험을 수행 할 계획이며 식품과 의약품 등의 원료 물질로 사용하기위한 2차 정제 공정에 대한 연구와 추출물의 안정성검토를 수행 할 예정이다.

참고문헌

[1] Leuenberger, H. G. W., Proceedings of on international symposium

held at noodwijkerhout. The Netherlands, 14-17 (1985)

[2] Johnson, E. A., Suchumun, D. B. and An, Gil-Hwan., Appl. and

Environ Microbiol., 55, 116-124 (1989)

[3] N. F. Hard, Biotechnology letter, 10, 9, 609-614 (1988)

Fig. 1. Recovery of carotenoid and astaxanthin

for various temperatures and pressures

(a)            (b)

Fig. 2. TLC analysis of supercritical extracts from P. rhodozyma.

1 : astaxanthin, 2 : □-carotene, 3 : supercritical extracts

(a) methanol : acetonitrile : H2O = 85% : 10% : 5%

(b) Acetone : Hexane = 18% : 82%