다중 어레이 면역센서의 분석성능을 조절하는 면역화학적 인자

백세환

고려대학교 생명공학원

Immunochemical Factors Controlling the Performance of a Multi-Arrayed Immunosensor

Se-Hwan Paek

Graduate School of Biotechnology, Korea University

Introduction to the Immunosensor Project

구조가 비교적 복잡한 유기물질 (단백질, 호르몬, 바이러스 등)의 분석을 위해 면역분석이 일반적으로 사용된다.  전통적인 한 방법으로, 분석물질에 특이한 항체를 고체표면 (유리, 플라스틱 등)에 고정화시킨 후 분석물질을 가하면 고체상에서 항원-항체 결합이 형성되고 이에 신호발생원이 표지된 항체를 반응시키면 분석물질을 중심으로 소위 □샌드위치□ 형상의 결합체를 얻게된다.  이 결합체에 포함된 표지물질로부터 분석물질 농도에 비례한 신호를 발생시킴으로써 정량분석이 수행된다. 면역센서에서는 신호로써 전기 혹은 광학 신호가 전형적으로 채택되는데, 예를 들어 전기신호의 발생을 위해 전극 혹은 반도체가 주로 사용된다 (그림 1 참조).  이와 같은 분석시스템은 항원-항체 결합반응을 단시간 내에 전기신호로 변환해 주는 잇점을 준다.  전극은 현재 가장 보편화되고 잘 정의된 트랜스듀서이고, 반도체는 그 기술의 혁신적인 발달로 저가의 대량생산과 체내 이식이 가능할 정도의 초소형화 등의 장점을 제공하므로 미래의 트랜스듀서로써 각광을 받고 있다.

	그림 1. 다중 어레이 면역센서의 한 예.

의료, 환경, 그리고 식품위생 등 다양한 분야에서 분석이 요구되는 지표물질들 중 많은 경우 상호 관련성을 갖는 복수의 물질들이 한 시료 내에 존재하므로 이들을 동시 측정하는 분석시스템의 개발이 요구된다.  따라서 우리 연구팀은 분석현장에서 속성측정이 가능한 소형화된 다중 어레이 면역센서 (그림 1) 개발을 시도하게 되었고, 그 초기단계로써 일정 고체표면의 다중 분할에 따라 발생하는 항체 고정화면적의 감소를 극복하기 위한 효과적인 항체고정화 전략을 수립하였다.

Production of Immunochemicals as Binding Reagents

효과적인 항체고정화를 위해 항체분자 크기의 조절이 가능하도록 다양한 항체생산방법이 개발되고 있다.  기존에 사용되어 오던 하이브리도마 세포를 이용하는 방법은 일반적으로 Immunoglobulin G (IgG) 종류의 항체 (그림 2 참조)가 생산된다.  이 항체분자는 1,300여개의 아미노산으로 구성된 거대분자이고 그 분자상의 항원부착자리는 상대적으로 매우 작아서 고정화 시 그 상태에 따라 기능성을 잃기 쉽다.  실제로, 일반 면역분석시스템에서 고정화된 총 항체 중 항원-항체 반응에 참여하는 분자는 약 10%를 하회한다.  이러한 문제의 해결을 위한 접근으로 환원조건 하에서 IgG 분자를 더 작은 단위인 Fab 혹은 Fv 절편으로 만들 수 있지만 반응과 정제공정이 추가된다.  다른 항체제조방법으로 유전자재조합에 의해 만들어진 1억개 이상의 single chain antibody variable genes를 phagemid vector에 삽입시켜 얻어진 synthetic antibody library를 이용한 항체생산기술을 이용할 수 있다. 이 library에는 매우 광범위한 항원에 대한 단일클론항체 (scFv, 그림 2 참조)가 이미 존재하므로 특이 항체의 선별과정 (panning)을 거친 후 bacteria에 감염시켜 대량생산 (1-50 mg/L) 될 수 있다.  이 방법은 하이브리도마 과정에 비해 2-3 개월이 소요되는 면역화 단계의 생략, 면역화가 잘 안되는 항원에 대한 항체 생산, 필요로 하는 affinity를 가진 항체의 용이한 선별, 항체구조의 자유로운 변형 (fusion protein), 실험동물 사용배제, 동물세포배양에 비해 저렴한 비용 등의 추가적인 장점을 들 수 있다.

그림 2.  다양한 생산공정에 의해 제조될 수 있는 항체분자의 종류.

Methods of Antibody Immobilization

항체의 고정화 방법은 고체상에서 항원-항체 반응결합체 형성에 크게 영향을 주는 인자로써, 일반적으로 물리흡착, 화학적고정화, 그리고 부착단백질을 이용하는 방법으로 나눌 수 있다.  물리흡착은 고체표면과 단백질분자 간의 이온 및 수소결합 그리고 소수성 상호작용 등 약한 결합에 의해 항체를 고정화시키는 방법이다.  이 방법은 수행과정이 비교적 간단한 장점이 있는 반면에 고정화된 항체가 수용액에 포함된 성분들 (예를 들어, 계면활성제, 흡착력이 강한 단백질 등)에 의해 탈착될 수 있는 잠재성을 내포한다.  화학적 고정화는 고체표면에 기능성그룹을 도입시키고 이 그룹을 단백질의 기능성그룹 (주로, amino 그룹, carboxyl 그룹, 혹은 sulfhydryl 그룹)과 화학반응시키는 방법으로써 과정은 비교적 복잡하지만 매우 안정된 항체고정화를 성취할 수 있다.  또한, 제2항체와 Protein G 등과 같은 항체분자에 대한 부착단백질을 매개로 항체고정화를 성취할 수 있다.  비교적 제조비용이 많이 들지만 항체의 기능성이 손상될 기회가 작고 매우 낮은 농도의 항체가 될 수 있다.  상기한 세 방법 중 부착단백질을 매개로 이용하는 방법이 가장 높은 면역결합체 밀도를 제공하는 것으로 보고되어 있다.

Molecular Dimension of Antigen

고체표면에서 항원-항체 반응에 의해 형성되는 면역결합체 밀도는 측정하고자 하는 분석물질의 크기에 따라 현저히 변화되는데 이것은 고정화된 항체분자간에 조성된 공간이 제한되어 반응을 위한 항원의 접근성이 감소되기 때문이다.  고체상에 항체용액을 가하면 항체분자는 그 표면에 도달되어 □sliding' 기작에 의해 lateral diffusion 과정이 야기되고 추후 열역학적으로 가장 안정된 상태로 고정화된다.  그 다음 항체분자가 고체상에 도달되면 단백질 간 상호작용에 의해 처음 고정화된 분자와 접촉되거나 그 근처에 안정화된다.  이와 같은 과정의 반복에 의해 항체분자들은 결국 cluster 형태로 고정화되고 부분적으로 편중된 분포를 이루게 된다.  이러한 현상은 분자크기가 큰 분석물질의 경우 상대적으로 항체분자 상의 항원부착자리에 대한 접근이 어려워지고 따라서 고체상에 형성된 면역결합체 밀도는 분석물질 크기에 반비례하여 감소된다.  또한, 용액 내 항체농도를 증가시키면 항체 cluster 크기도 비례하여 늘어나지만 항원과의 면역반응은 cluster 가장자리에 국한되어 면역결합체의 밀도는 거의 일정하게 된다.  결론적으로, 다중 어레이 면역센서의 측정민감도는 고체상에 형성된 면역결합체 밀도에 의해 절대적으로 결정되므로 패턴방식의 도입에 의한 고정화된 항체분자의 분산방법의 개발이 요구된다 (그림 3).

그림 3.  다중 어레이 면역센서 제작을 위한 항체고정화 기술 개발목표.

Cross-reaction

다중 어레이 면역센서의 경우 동일한 고체표면 상에서 다중 항원-항체 반응이 동시 수행되므로 잠재적인 문제점으로써 다른 반응 간 교차반응의 발생은 비특이 잡음신호를 증가시켜 측정민감도를 감소시키고 또한 위양성 결과를 초래한다.  이와 같은 문제점을 제거할 수 있는 방법으로 단일클론 항체생산 시 screening 단계에서 규격에 맞는 항체를 선별하거나, 복합클론 항체의 경우 생산 후 친화 크로마토그래피 공정을 이용하여 교차반응하는 항체에 대해 negative absorption 과정을 수행할 수 있다.  부가적으로, 교차반응은 반응계의 화학적 조건 (예: 비반응성 단백질 및 계면활성제의 조성, 이온농도 등)의 조절에 의해 최소화될 수 있다.  이러한 효과는 항체분자가 단백질 혹은 계면활성제와 상호작용하거나 또는 비특이 부착자리의 블로킹에 의한 것으로 예측된다.

Quantitation of Immune Complexes

고체표면에 형성된 면역결합체의 정량은 위에서 언급한 바와 같이 다양한 트랜스듀서를 이용하여 수행될 수 있다.  분석공정의 단순화와 시간의 단축은 표지물질을 사용하지 않고 고정화된 항체와 항원 간 반응을 직접 모니터링할 수 있는 기술 (예: surface plasmon resonance)의 도입에 의해 성취될 수 있지만 광학측정방법은 다중 어레이 면역센서 시스템에서는 일반적으로 여러 개의 광원과 탐지장치가 요구되므로 현장분석을 위한 장치의 소형화에는 적합하지 않다.  소형화된 장치의 구성을 위해 전기화학 트랜스듀서가 적합하고 체내이식 등 초소형화된 센서의 제작을 위해서는 반도체 기술의 접목이 요구된다 (그림 1 참조).