Aspergillus niger에서 추출되는 포도당 산화효소의 정제

박 현 규, 허 윤 석, 황 우 성*, 김 인 호

충남대학교 화학공학과, *RMC Korea

Purification Study of Glucose Oxidase from Aspergillus niger

Hyun-Kyu Park , Yun-Seog Huh, Wu-Sung Whang* and In-Ho Kim

Department of Chemical Engineering,

Chungnam National University, Teajeon, 305-764

*RMC Korea, TIC/TBI Center in KAIST

서 론

Glucose Oxidase(GOD)는 □-D-Glucose를 산화시켜서 Glucono-□-lactone으로 만들고, 이 반응에 사용되는 산소를 과산화수소로 환원시키게 된다:

□-D-Glucose + O2                 Glucono-□-lactone + H2O2.

본 연구에서는 Aspergillus niger를 사용하였으며, 이 Fungi에서 추출된 GOD는 2개의 FAD(Flavin Adenine Dinucleotide)로 이뤄져 있으며 그 분자량은 대략 150,000정도이다. 또한, Gluconic acid를 만들어내는 GOD는 산소 선택성이 좋아 저장용 식료품 산업에 이용하기도 한다. 그리고 Glucose의 농도를 분석하기 위한 바이오센서의 고정화 효소등으로 사용되어지고 있다.(1)

이용가치가 많은 GOD를 분리정제하기 위한 연구는 이미 많이 이뤄져 있다. 그 대표적인 방법으로 Ammonium sulfate fractionation(2)과 DEAE-Cellulose(3)를 이용한 방법이 있는데 전자의 방법은 효율은 높지만 Specific activity(U/mg protein)가 그렇게 높게 증가되지 못하며 후자의 경우는 Specific activity만 조금 더 높게 나타날 뿐이다.

이미 연구된 정제 과정에 의하면 과정이 복잡하고 여러 단계로 수행함에 따라 GOD의 수율이 떨어진다. 따라서, 본 연구에서는 간단한 정제 방법으로 높은 수율의 GOD를 얻는데 있으며, 이를 위해 사용된 이온 교환기는 GOD의 용출에 있어서 끌림 현상이 양이온 교환기보다 적게 나타나는 음이온 교환기 DEAE-Sepharose를 사용하였으며 사용한 완충용액은 오염물질을 보다 잘 제거할 수 있는 McIlvane buffer를 사용하여 이온교환 크로마토그래피(IEC)로 수집된 GOD의 농도 결정과 Specific activity의 측정으로 고수율/고순도의 GOD를 얻을 수 있는 비교적 간단한 정제과정을 찾았다.

실험재료 및 방법

생산 균주의  배양

본 연구에 사용한 균주는 ATCC 9029 Aspergillus niger를 복합 배지 100ml을 500ml 용량의 Baffle flask를 사용하여 Shaking incubator에서 배양하였다.

분리 및 정제

배양액의 상등액만을 분리, CM-Sepharose CL-6B, DEAE-Sepharose CL-6B를 사용하였으며 필요한 시료는 Table 1에 근거하여 준비하였다.

GOD를 정제함에 있어서 중요한 것은 이온교환기의 선택, 용출 Buffer의 pH,   용출 용매의 단일성 여부를 결정하여 효소 정제에 필요한 조건을 찾는데 있다.

Table 1. Explanation of various samples.

분석 방법

균체의 생육은 육안으로 관찰이 가능하며 그 배양액 중 Protein의 농도 및 GOD의 역가를 측정하였는데, 먼저 Protein의 농도는 Bradford 방법으로서 595nm에서 흡광도를 측정하였으며, GOD의 역가는 다음 반응식에서와 같이 ABTS(2,2'-azio-di-〔3-ethyl- benzthiazoline-6-sulphonic acid〕) 용액의 색깔 변화를 420nm(2) 에서 시간에 따른 변화량을 측정하였다.

Peroxidase

H2O2 +2H+ + ABTSRed                   ABTSoxd +2H2O

GOD 단백질의 순도는 포함된 불순물 함량의 직접 측정과 GOD 활성 이외의 효소 활성으로써 Cellulase와 Catalase의 포함을 정량하는 것으로 전자는 전기영동으로 후자는 Catalase 활성도의 직접적 또는 간접적인 측정이 있다.

SDS-PAGE and HPLC

GOD의 분자량은 대략 150,000 정도인데 Table 1에 근거하여 얻어진 GOD의 불순물 함유 정도를 15% SDS-PAGE를 사용하여 확인하였다.

또한, GOD는 4.6mm I.D×250mm L의 C18 컬럼에서 이동상을 10% water와 90% 아세토나이트릴 조성으로 용리를 시켰을 때 체류시간이 약 4분 정도이며,  이때의 유속은 0.5ml/min으로 흘려보냈다.

단백질 농도 및 GOD 역가 측정

GOD는 270∼280, 375∼380, 450∼460nm(4)에서 최대 흡광도을 나타내며 본 연구에서 역가(U/mg protein)는 A420을 측정하였다. GOD의 역가는 Table 2에 나타난 Protocol (Total vol = 1.20ml)을 근거로 측정하였다.

Table 2. Protocol for measurement of GOD activity.

	Blank	GOD	Catalase	최종농도
Glucose, 1.5M	0.2	0.2	0.2	250mM
ABTS, 20mM	0.1	0.1	0.1	1.65mM
Na-Azide	0.02	0.02	·	2.0mM
Buffer, 0.2M pH5.8	0.8	0.79	0.81	132mM
HRP, 40U/mL	0.08	0.08	0.08	2.6U/mL
효소용액	·	0.01	0.01	시료GOD

실험 결과 및 고찰

이온교환기 및 Buffer의 영향

GOD의 pI=4.2로서 Chromatography 정제에 필요한 용출 Buffer를 선택하기 위한 기준으로 하는 경우 정지상은 통상적으로 양이온 교환기이지만 Fig. 1에서 보여지듯이 GOD 활성 단백질의 용출이 초기부터 시작되고 용출 부분이 끌림 현상을 보이는 것으로 보아 양이온 교환기를 이용한 Chromatography는 부적절하다는 것을 알 수 있다. 또한, pH가 낮을수록 초반부에 Protein이 과량으로 용출되기 때문에 GOD만의 분리가 어려워짐을 확인 할 수 있으므로 pH를 pI보다는 높게  해야한다. 그러나 같은 경향에 있어서도 Citrate buffer를 사용하였을 때는 GOD의 용출이 늦게 되면서 불순물의 제거가 잘 이뤄지지 않았다. 따라서, 오염물질을 보다 잘 제거할 수 있는 완충용액으로 McIlvane buffer를 사용하였다.

용출 Buffer의 농도가 낮을수록 불순물의 단백질은 제거가 잘 되지만 GOD 단백질의 용출에 있어서 끌림 현상이 나타나기 때문에 그 농도는 0.1M이 적당함을 확인하였으며 IEC에 사용된 용출 Buffer의 기준으로 삼았다. 따라서 GOD의   정제를 위한 Ion exchange chromatography의 조건은 DEAE-Sepharose anion exchanger, 0.1M McIlvane buffer, pH6.0이 적절함을 알 수 있었다(Fig. 2).

한 번 수행된 컬럼은 1.0N HCl, 1.0N NaOH 와 증류수로 재생시킨 후 다시 사용하였다.

Fig. 1. Cation exchange chromato- graphy; CM-Sepharose CL-6B column 22mm I.D × 110mm L, 0.1M Citrate buffer pH 3.18.

Fig. 2. Anion Exchanger Chromato- graphy; DEAE-Sepharose CL-6B, 50mm I.D×80mm L, 0.1M McIlvane buffer pH 6.0.

단백질 농도 및 GOD 역가 측정

표준 단백질 BSA(BioRad, 0.15mg/ml)를 사용하여 Bradford 방법으로 Table 1의 정제된 Sample 농도(mg/ml)를 측정한 결과가 Table 3에 나타나 있다. 단, Chromatogram 분석에 있어서는 파장 280nm에 의한 흡광도로 같이 사용하였다.

Table 3. Determination of concentration and sp. activity of

various sample in Table 1.

Sample No.(Lane)	2	3	5	6	7	8	9	10	11
Conc.	1.4526	2.015	3.1271	5.6973	1.6695	5.2847	5.3158	5.0659	2.010
Sp. activity	136.29	185.61	141.58	202.73	207.55	233.13	173.82	303.99	214.0

따라서, GOD를 정제함에 있어서 고농도이면서 높은 역가를 갖도록 하고자 할 때는 Table 1의 Sample No. 10과 같은 방법으로 준비하였을 때 얻을 수 있었다.

Glucose Oxidase의 SDS-PAGE와 HPLC

Aspergillus niger를 배양한 후 얻어진 조효소액을 황산암모늄을 이용한 분별 침전, 0.01M Sodium phosphate buffer를 이용한 Dialysis, DEAE-Sepharose 칼럼 크로마토그래피를 행하여 GOD를 정제하였으며, 여기에 필요한 Sample 준비는 Table 1 과 같다. 준비된 Sample은 전기영동(Fig.3)을 통하여 GOD가 갖는 분자량은 Monomer 형태가 약 78,000(Lane 2,3,11)이며 Dimer 형태는 112,000 (Lane 5∼10)정도의 두 가지 유형으로 존재함을 확인할 수 있었다(5). 따라서, Monomer를 얻고자 할 경우에는 Table 1에서 볼 수 있듯이 Ammonium sulfate fractionation과 0.01M Sodium phosphate buffer, pH6.0 으로 Dialysis 단계를 가지게 되면 얻을 수가 있으며 Dimer 형태는 단순하게 Crude한 조효소액을 원심분리만을 통하여 1차로 불순물을 제거한 후 Ion exchange chromatography를 거치면 얻을 수 있음을 알 수 있게 되었다.

이렇게 얻어지게 되는 각 Sample에 대한 GOD의 순도를 확인하기 위하여 10% Water 와 90% 아세토나이트릴으로 이루어진 이동상으로 용리시켰는데 Fig. 4.에서 볼 수 있듯이 체류시간 3∼4분 사이의 GOD peak를 제외한 다른 Peak는 거의 보이지 않는 것을 미루어 보아 순도가 95%이상으로 높게 얻을 수 있었다.

Fig. 3. 15% SDS-PAGE of various preparations.

참고 문헌

Fig. 4. HPLC chromatograms of various preparations; C18, 4.6mm I.D×250mm L, Moble phase with 10% water and 90% acetonitrile and 0.5ml/min flow rate.

1. 홍성현,김태진,정용섭,김승욱,윤정원 □바이오센서용 CTA와 PCL 혼합막에의      효소고정화 기법의 개발□ Korean J. Biotechnol. Bioeng. 10(4), 468-474(1995).

2. Pazur, J. H. and Kleppe, K., "The Oxidation of Glucose and Related          compounds by Glucose Oxidase from Aspergillus niger", Biochemistry 3,      578(1964).

3. Swoboda, Bennett E. P. and Massey, V.,"Purification and Properties of the    Glucose from Aspergillus niger", Biological Chemistry 240, 2209(1965).

4. The MERK INDEX 11th ed., p. 4354.

5. 한상배,김광진,임한진,김태년,최동성 □Aspergillus niger Glucose oxidase의 새    로운 정제방법 및 특성□, Korean J. Biotechnol. Bioeng. 9(1), 55-62(1994).