초기 질소 및 인성분의 농도가 B. braunii의 성장과 탄화수소 생산에 미치는 영향

안 진영1,2, 최 정규1,3, 심 상준1, 김 병우2

한국과학기술연구원 청정기술연구센터1, 성균관대학교 화학공학과2

서울 산업대학교 정밀화학과3

Effects of initial N and P concentration on cell growth

and hydrocarbon production in the culture of Botryococcus braunii

J. Y. An1,2, J. G. Choi1,3, S. J. Sim1. and B. W. Kim2

Clean Technology Research Center, Korea Institute of Science and Technology1

Department of Chemical Engineering, Sungkyunkwan University2

Department of Fine Chemistry, Seoul National University Technology3

서 론

건조질량의 15∼75 %의 탄화수소를 생산한다고 알려진 군체성 녹조류인 Botryococcus braunii는 화석연료를 대체할 재생 생물연료(renewable biofuels)로 제시되고 있다. 생산된 탄화수소의 대부분은 균주 외벽의 다당류에 의해 형성된 matrix인 external pool에 존재한다 [Metzger et al., 1985 and Casadevall et al., 1985].

B. braunii는 질소원이 결핍된 상태에서 탄화수소의 함량이 증가된다고 보고되었다 [Richmond, 1986]. 그러나 일반적으로 녹조류의 경우, 질소원이 결핍될 때 엽록소와 핵산의 함량이 줄어들고, 반면 광합성을 위한 보조색소인 카로테노이드가 축적되어 황갈색으로 변색되게 되고, 광합성 및 호흡의 활성이 저하되게 된다. 단백질의 필수성분인 질소원의 결핍으로 단백질합성에 저해를 받게 되고, 내인성대사에 의해 단백질이 소모됨으로 인해 균주내 단백질 함량이 떨어지고, 상대적으로 탄수화물이나 탄화수소의 함량이 높아지게 된다. 따라서 질소원 결핍시 탄화수소의 함량이 증가된다는 것은 탄화수소 생산량이 증가되는 것이 아닌 것으로 추정된다. 또한 탄화수소의 함량이 높아짐으로 인해 균주의 비중이 낮아짐으로 인해 균체의 부양현상이 발생하게 된다 [Fogg,1966].

본 연구에서는 기존의 Chu 13 배지에서 초기 질소원과 인성분의 농도가 B. braunii의 성장과 탄화수소 생산에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 또한 질소원이 균체 성장의 제한요인으로 작용되는 농도를 찾아내어, 장기배양, 유가식 회분배양(fed batch culture) 및 연속배양시 유리한 배지조성 및 운전조건을 최적화하고자 하였다.

실험 방법

사용된 균주는 군체성 녹조류인 Botryococcus braunii UTEX 572이며, 배지는 modified Chu 13을 이용하였다.  250 ml flask내에서 14일 마다 계대배양을 실시하여 bubble column에 10 % (v/v)로 접종하였다. 본 연구에 사용된 500 ml 용량의 bubble column에서의 배양조건은 외부광도를 100 □E/m2·s로 연속적으로 공급하였고, 배양온도는 25℃로 고정하였고, 1% CO2 혼합공기를 100 ml/min으로 공급하였다. 질소원과 인성분이 균체성장 및 탄화수소 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여, Chu 13 배지에서 초기 질소원과 인성분의 농도를 변화하여 실험하였다. 배지에 질소원과 인성분의 농도변화를 측정하기 위해 배양액의 원심분리후 상등액을 취하여 ion chromatography(Waters 432 conductivity detector, Alltech Associates, Inc. USA)를 이용하여 분석하였다. 균체 활성도와 광합성 활성을 추정하기 위한 엽록소 a와 b의 분석은 메탄올 추출 후 665 nm와 650 nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 산출하였다. 균체의 농도는 680nm에서 흡광도를 측정하여 건조중량을 추정하였다 (Dry biomass (g/L) = 0.515 × OD680). 탄화수소는 10 ml 배양액을 80℃, 24 h 건조시킨 후 aceton과 초음파균질기(VC 100, Materials & Sonics Inc., USA)를 이용하여 추출한 다음, silica gel로 충진된 chromatograph column(2×7cm)에서  탄화수소만을 정제한 다음, GC(FID)로 분석하였다. 정량을 위한 internal standard로 squalene을 사용하였다.

결 과

질소원의 농도가 균체성장 및 탄화수소 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여, Chu 13 배지내 초기 인의 양(45 mg PO43-/L)을 고정시키고  질소원의 초기농도를 변화하여 실험하였다. Fig. 1은 Chu 13 배지내 기본 질소원의 농도인 236 mg NO3-/L를 1×N으로 하여 기준으로 삼고,  질소원 결핍배지인 1/5×N, 질소원을 과잉으로 공급한 2×N, 4×N, 10×N, 20×N 배지내에서 균체의 성장을 나타낸다. Fig. 1을 살펴보면, 배양초기부터 질소원의 결핍에 의한 저해를 받기 시작하는 1/5×N의 경우를 제외하면, 0.033 ∼ 0.034 h-1의 거의 같은 비성장속도를 보이다가 질소원이 고갈된 후 성장이 둔화되는 걸 알 수가 있다. 20×N의 경우 배양초기부터 과잉의 질소원으로 인한 저해를 받았지만, 시간이 지날수록 질소원의 고갈이 없기 때문에 지속적인 성장을 보였다. Fig. 2는 control culture인 1×N의 경우, 성장속도와 엽록소, 그리고 질소원의 농도변화를 나타낸다. 이 경우 배양후 4∼5일 사이에 질소원이 거의 고갈되어 성장이 둔화되고, 엽록소 함량이 급격히 줄어드는 것을 보여준다. 질소원의 고갈후 균체의 색은 녹색에서 황갈색으로 변화하였다. Fig. 3은 이 경우의 탄화수소 농도변화를 나타낸다. 질소원의 고갈후 탄화수소의 생산은 둔화되었으며, 초기 질소원의 농도에 따른 비성장속도, 최대 탄화수소 농도와 탄화수소 생산속도를 Table 1에 정리하였다. 4×N의 경우, control culture에 비해 2.2배의 탄화수소 생산량이 증대되어, 가장 효율적인 초기 질소원의 농도로 사료된다.

초기 인성분의 농도가 균체성장 및 탄화수소 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 마찬가지로 Chu 13 배지내 초기 질소의 양(236 mg NO3-/L)을 고정시키고  인의 초기농도를 변화하여 실험하였다. Fig. 4는 Chu 13 배지내 기본 인의 농도인 45 mg PO43-/L를 1×P로 하여 기준으로 삼고,  인 결핍배지인 1/5×P, 인을 과잉으로 공급한 2×P, 4×P, 10×P, 20×P 배지내에서 균체의 성장을 나타낸다. 인 결핍배지인 1/5×P의 경우, 어느정도 저해를 받으면서 지속적인 성장을 하였고, 나머지 경우 비성장속도가 0.027 ∼ 0.030 h-1으로 질소원이 고갈되어 성장이 둔화되기 전까지 거의 유사한 성장을 보였다. 이와 같은 이유는 대부분의 녹조류는 배양초기 (3 day 이내)에 균체가 필요로 하는 양 이상의 과잉의 인성분을 섭취하여, 균체내에 다중인산염(polyphosphate) 형태의 입자로 보관하게 된다. 이러한 녹조류는 인 섭취에 있어 매우 낮은 half-saturation 상수를 가진다. 따라서 배양 3∼4일 후 인성분이 고갈된 배지내에서도 성장이 계속되게 되는 것이다. 그러므로 초기 인 농도는 B. braunii 성장에 있어 다른 변수에 비해 거의 독립적이라고 할 수가 있다 [Casadevall et al., 1985].  그러나 Chu 13 배지내 기준 인성분의 양보다 결핍된 배지의 경우, 어느 정도 성장의 저해를 가져왔기 때문에 장기배양시 인 결핍에 대한 성장의 둔화를 고려해야 할 것이다.

본 연구에서는 다양한 초기 질소 및 인 농도 변화 실험을 통해 균체성장 및 탄화수소 생산에 최적의 배양 조건을 찾고자 하였다. 초기 인의 농도는 균체 성장에 거의 독립적이었고, 4×N-1×P의 초기 질소원 및 인성분의 농도가 회분식 배양시 탄화수소 생산면에서 최적의 배양조건으로 선정되었다,  또한 기존의 Chu 13 배지의 경우 4∼5 day 이후 질소원의 고갈로 인해 균체성장 및 탄화수소 생산이 둔화되기 때문에 장기배양시 Chu 13 배지보다 과량의 초기 질소원이 요구되며, 질소원이 고갈되기 전에 유가식 회분배양 및 chemostat에 의한 추가 질소원의 공급이 필요하다고 사료된다.

참고 문헌

A. E. Richmond, "Microalgaculture", Crit. Rev. Biotechnol. 4, pp 369-438 (1986)

E. Casadevall, D. Dif, and C. Largeau, "Studies on batch and continuous culture of Botryococcus braunii", Biotech. Bioeng., vol. 27, pp 286-295 (1985)

G. E. Fogg, "Algal cultures and phytoplankton ecology", The University of Wisconsin Press, pp 44-52 (1966)

P. Metzger, C. Berkaloff, E. Casadevall and A. Coute, "Alkadiene- and botryococcene- producing races of wild strains of Botryococcus braunii", Phytochemistry, vol. 24, pp 2305-2312 (1985)

Table 1. Comparison of Specific growth rate, max. concentration of hydrocarbon, and hydrocarbon production rate under various initial nitrate concentration.

(a) h-1, (b) g hydrocarbon/L, and (c) mg hydrocarbon/L·d

Fig. 1. Growth curve of B. braunii under various initial nitrate concentration in the bubble column.	Fig. 2. Time courses of dry cellmass, chlorophyll, and nitrate under control culture(1×N) in the bubble column.
Fig. 3. Hydrocarbon production over time under various initial nitrate concentration in the bubble column.	Fig. 4. Growth curve of B. braunii under various initial phosphate concentration in the bubble column.