Poly-lysine tagging된 EGF-angiogenin 융합단백질 내포체의 고체상 재접힘

박상중, 채영규*, 권오병**, 박승국**, 이은규

한양대 화학공학과 생물공정연구실, 한양대 생화학과*, 대웅제약 중앙연구소**

Solid-phase refolding of poly-lysine tagged fusion protein inclusion body of

EGF and angiogenin

Sang Joong Park, Young Gyu Chai*, Oh Byung Kweon**,

Seung Kook Park**, Eun Kyu Lee

Dept of Chem. Engineering, *Dept. of Biochemistry & Molecular Biology,

Hanyang Univ., **Central R&D, Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd.

서론

최근에 세포독성을 갖는 단백질을 암세포 인식부위와 결합시켜 암세포만을 선택적으로 괴사시키는 방법이 개발되고 있다[1, 2]. 암세포를 인식할 수 있는 인식부위와 괴사작용을 할 수 있는 toxin이 linker에 의해 연결되어 입체구조를 이루며 서로 다른 두 가지 활성을 갖는 융합단백질이 된다.

본 연구에서는 EGF(epidermal growth factor) (pI 4.5; 6 kDa)를 암세포 인식부위로 사용하고 RNA 분해능력과 단백질 합성 저해능력을 갖는 angiogenin(pI 9.0; 14 kDa)을 5개의 아미노산으로 연결시킨 융합단백질(E5A)을 E. coli에 의해 내포체 형태로 발현시킨 후, 높은 재접힘 수율을 얻기위해 여러 가지 재접힘 공정을 적용하였다. 전통적인 방법은 심한 응집으로인해 높은 수율을 얻기 힘들었다. 그래서 응집을 최소화할 수 있고 고농도 재접힘이 가능한 solid-phase refolding을 적용하였다[3].

양이온교환수지와 Heparin-Sepharose에 대한 높은 흡착률을 얻기위해  6개의 lysine 잔기와 tagging된 부분을 추후에 절단하기 위한 factor-Xa cleavage sequence를 tagging하였다(6L10E5A)[4]. 본 논문에서는 전통적인 solution-phase refolding 결과와 solid-phase refolding을 각각 tagging된 융합단백질(6L10E5A)과 tagging되지 않은 융합단백질에 적용한 결과를 요약하였다.

재료 및 방법

(1) 융합단백질의 발현

EGF를 coding하는 유전자로서 hEGF 발현 벡터 pTE105를 사용하였으며, human angiogenin의 유전자를 human liver cDNA library로부터 얻어 plasmid pRSET A에 cloning하였다. 이 균주와 6L10E5A 발현용 균주는 (주)대웅제약에서 제작하였다[5].  융합단백질 발현을 위한 재조합 대장균의 발효에는 GNPF 배지를 사용하였다.  Exponential phase 중반부에 1 mM IPTG로 단백질 발현을 유도하였다.  상세한 발효 및 발현 절차는 기존 논문에 제시하였다[6].

(2) 내포체 회수 및 용해

발효 후 세포는 12000 rpm에서 20분간 원심분리하여 회수하였다. 회수된 세포를 SDS-PAGE와 western blotting을 이용하여 목적단백질의 발현여부를 확인하고, densitometer를 사용하여 목적단백질의 발현량을 측정하였다. 회수된 세포는 cell lysis buffer(100 mM sodium phosphate, 1% Tween 20)를 가한 후에 초음파분쇄기를 사용하여 강도 7에서 30분간 세포파쇄를 실시하였다. 파쇄된 세포를 8000 rpm에서 30분간 원심분리후 wash buffer(50 mM sodium phosphate, 1% Tween 20)를 사용하여 3회 세척하였다. 세척된 IB를 용해 buffer(8M urea, 50 mM sodium phosphate)에 용해시켰다.

(3) Solid-phase refolding

두 가지 용해된 단백질(E5A, 6L10E5A)을 각각 여러 가지 resin (CM- Sepharose, SP-Sepharose, Q-Sepharose, DEAE, Heparin-Sepharose, Phenyl- Sepharose)에 흡착시키기 위해 pH, 이온강도에 따른 equilibrium adsorption capacity(평형흡착능)를 비교하였다. 그리고 CM-Sepharose와 Heparin-Sepharose column을 이용한 solid-phase refolding을 수행하여 recovery yield를 비교하였다. Heparin-Sepharose eluate를 대상으로 tRNA assay를 사용하여 목적단백질의 활성을 측정하였다.

결과 및 고찰

(1) E5A의 흡착능

E5A 내포체를 대상으로 전통적인 방법인 신속한 희석과 투석을 이용한 refolding을 수행하였을 때 투석 후 심한 응집현상으로 인해 매우 낮은 refolding yield(4.8%)를 보였으며 24시간 정도의 긴 재접힘 시간이 필요하다[7]. 이런 단점을 극복하기 위해 용해된 단백질을 특정 resin에 흡착시킨 후 변성제를 제거해 줌으로써 단백질간의 interaction을 줄여 응집을 최소화하며 많은 양의 단백질을 처리할 수 있는 solid-phase refolding을 도입하게 되었다. Solid-phase refolding적용을 위한 기초실험으로서 4가지의 이온교환수지(CM-Sepharose, Q-Sepharose, Sephadex C-50, DEAE-Sepharose)를 이용하여 pH 6, 7, 8, 9, 10에서의 adsorption capacity를 측정하였다 (Fig. 1 참조). 각 resin에 따라서 약간씩의 차이는 있었으나 모든 경우에 adsorption capacity는 30% 이하이었다. 또한 CM-Sepharose를 사용하여 다른 이온강도 (50, 100, 200, 300, 400mM)에서의 adsorption capacity 측정실험과, DEAE와 CM-Sepharose resin을 1:1의 비율로 섞어 만든 mixed resin을 사용한 실험에서도 40% 이하의 낮은 adsorption capacity를 보였다. 이온교환수지 외에 hydrophobic interaction resin인 Phenyl-Sepharose을 사용한 실험에서도 별다른 차이를 볼 수 없었다. 전체적으로 볼 때 어떤 resin에도 adsorption capacity가 매우 낮은 E5A를 solid-phase refolding하는 것은 타당성이 약했다. 이는 EGF와 angiogenin가 서로 다른 pI에 의해 상반된 전기부하를 띠기 때문인 것으로 사료된다.

(2) 6L10E5A의 흡착능

양이온교환수지에 대한 강한 affinity를 가지게 하기 위해 6개의 Lys을 EGF의 N-terminal에 tagging하였다. Poly-lysine이 tagging된 6L10E5A를 대상으로 solid-phase refolding용 흡착 실험을 위해 내포체를 용해 후 4가지의 resin (CM-Sepharose, Q-Sepharose, DEAE-Sepharose, Heparin-Sepharose)에 흡착시켰다 (Fig. 2 참조). CM-Sepharose 경우 pH 6에서 65% 정도의 adsorption capacity를 보였으며, 이것은 E5A에 비해 6L10E5A의 adsorption capacity가 2.5∼3배 가량 증가하였음을 보여준다. 또한 Heparin-Sepharose 경우 pH 6에서 88%의 높은 adsorption capacity를 보였다. 이것은 poly-lysine이 heparin에 대한 강한 affinity를 나타낸다는 것을 보여준다.  또한 angiogenin과 heparin 간의 높은 affinity도 흡착능 향상에 공헌한 것으로 유추된다[8].

(3) Solid-phase refolding

Heparin에 대한 높은 adsorption capacity를 확인 후 chromatography공정에 적용하였다. 2L 규모의 발효를 통해 최종 OD는 25, DCW 4.7 g/L, 17.0 g/L의 wet IB를 얻었으며, 목적단백질의 발현여부를 western blotting을 사용하여 확인하였다 (Fig. 3 참조). 얻어진 IB를 wash buffer를 사용하여 3회 세척 후 8 M urea 용액에 용해시켰다. Solid-phase refolding을 위해 8 M urea에 의해 평형된 Heparin-Sepharose에 10 mg의 total protein을 loading시켰다 (Fig. 4 참조). Urea washing응 통해 refolding 시킨 후 1.5 M NaCl로 목적단백질을 용출시켰다. 이때 용출액 내 단백질 농도는 2.0 mg/ml(총 4 mg)이었으며, 목적 단백질의 recovery yield는 63.6%이었다. 이 결과는 전통적인 방법인 solution-phase refolding에 비해 15배 정도의 수율 향상과 8배 정도의 공정시간 단축이었다. Heparin-Sepharose column에서의 용출액을 tRNA assay에 적용하였을 때 순수한 angiogenin 단량체에 비해 65% 정도의 활성을 나타내었다.

본 실험을 통하여 염기성 아미노산 잔기를 tagging한 융합단백질을 solid-phase refolding에 의해 고수율로 재접힘 시킬 수 있었으며, EGF와 angiogenin 융합단백질의 correct folding 여부를 확인하는 bioactivity 실험을 계속 진행중이다.

참고문헌

1. K. Psarras and M. Ueda, Human pancreatic RNase1-human epidermal growth        factor fusion: an entirely human 'immunotoxin analog' with cytotoxic properties      against squamous cell carcinomas, Protein Eng., 11, 1285-1292 (1998).

2. 윤종명, 상피세포성장인자와 안지오제닌의 융합단백질에 관한 연구,

서울대학교 약학과 박사학위 논문 (1998).

3. Creighton, T. E., Process for the production of a protein, US Patent 4,977,248(1989).

4. Rudolph et. al., Improved refolding of immobilized fusion proetein, Nature     Biotech., 14, 329-334 (1996).

5. Lee, K. M., Koh, Y. W., and Park, S. K.,  A novel gene coding human        epidermal growth factor and preparing the same, US Patent 8,360,841.

6. 이윤석, 인상피세포성장인자와 안지오제닌 융합단백질 생산을 위한 재조합

대장균의 발효 및 정제공정, 한양대학교 화학공학과 석사학위 논문(1999).

7. Kim, C. S., Kim, Y. H., and Lee, E. K., Engineering approaches to inclusion body     optimization, Korean J. Biotechnol. Bioeng., 13, 133-140(1998).

8. Fabrice Soncin et. al., Interaction of heparin with human angiogenin, J.         biological chemistry, 272, 9818-9824(1997).