pH 반응성 약물전달을 위한 BSA Tablet의 제조와 열분석

김준배, 박성배, 박함용, 함승주, 김우식

연세대학교 공과대학 화학공학과

Preparation and Thermal Analysis of BSA Tablets for pH-Sensitive Drug Carrier

Junbae Kim, Seong-Bae Park, Ham-Yong Park, Seungjoo Haam, and Woo-Sik Kim

Department of Chemical Engineering, College of Engineering, Yonsei University, Seoul 120-749, Korea

서론

최근 약물전달시스템에 대한 학문적인 관심사는 주로 표적지향성 전달수송체의 제조법에 집중되어 있으나, 생체적합성이라는 측면에서 전달수송체의 소재를 선택하는 것은 여전히 어려운 문제로 남아있다. 합성고분자의 경우 충분한 생체적합성이 보장되는 것은 드문 일이므로, 천연고분자는 아직도 상당한 매력을 지닌다고 할 수 있다. 특히 단백질의 일종인 albumin은 그 특성들 - 우수한 생체적합성, 화학적 수정이 가능함, 물에 대한 높은 용해도, 우수한 emulsification capacity, heat coagulability - 로 인하여 전달수송체의 소재로서 큰 가능성을 지니고 있다.

이 중에서 특히 heat coagulability를 이용하면 50℃ 이상의 온도에서 albumin의 분자들 사이에 가교반응을 일으키는 것이 가능하다. 이러한 직접적인 가교결합은 다른 천연고분자와 달리 가교제와 같은 첨가물을 필요로 하지 않기 때문에 생체적합성의 측면에서 유리하며, 가교제를 사용했을 경우 필연적인 세척 공정의 생략이 가능하기 때문에 전달수송체의 제조시에도 큰 장점을 지닌다고 할 수 있다.

본 연구는 이러한 albumin의 특성을 이용하여 열변성 BSA tablet을 제조하고, 일정한 환경변수 하에서 pH의 변화에 따른 팽윤제어기구의 특성을 고찰, 장차 약물의 전하와 외부 pH에 따라 약물방출속도의 차이를 나타내는 pH 반응성 팽윤제어계를 구현하고자 하였다. 또한 BSA의 열변성 과정에서 발생하는 내부의 구조적인 변화를 고찰하기 위하여 DSC를 이용한 열분석을 실시하였으며, 이를 통해서 제조 pH의 변화에 따른 BSA의 열적 특성을 고찰하였다.

실험

1. 열변성 BSA Tablet의 제조

먼저 Bovine serum albumin (BSA, SIGMA Chemical Co., A-7906)을 초순수에 120g/l의 농도로 용해시킨다. 이 용액을 4등분하고 0.5N HCl, 0.5N NaCl을 사용하여 BSA 용액의 pH를 각각 3.50, 4.80 (BSA의 등전점), 7.15 (BSA 용액의 초기 pH), 10.0으로 조절한다. pH 조절이 끝난 용액들은 5000rpm에서 30분간 원심분리하고 그 상청액에 대해서 aspirator를 이용, 용해되어있는 기체를 제거한다. 이 상청액들을 직경 13mm의 원통형 몰드에 넣고 water bath에서 80℃의 온도로 1시간 동안 가열한다. 가열 후 몰드들을 ice bath에서 90분간 냉각하고 열변성된 BSA gel을 몰드에서 꺼내 6mm 두께로 절단한다. 이를 desiccator에 넣고 상온에서 완전 건조시켜 열변성 BSA tablet을 얻는다.

2. 팽윤 실험

건조된 BSA tablet의 무게를 측정하고 팽윤용액으로서 pH 1.40, 2.50, 4.60, 5.50, 6.50, 7.40, 8.60, 9.20, 10.6의 인산완충용액 (이온강도 0.2로 고정)과 4가지 pH의 BSA tablet으로 팽윤계를 조성한다. 이들을 incubator (SI-900 shaking incubator, Jeio tech, Korea) 안에 넣고 37.5±0.5℃, 100rpm의 조건에서 36시간 동안 팽윤시킨다. 평형에 도달한 BSA tablet을 꺼내어 표면의 물기를 닦아내고 무게를 측정한다. 건조시의 무게와 팽윤시의 무게를 이용하여 팽윤도를 결정한다.

3. DSC 분석

건조된 BSA tablet을 DSC pan에 적합한 크기 (약 10mg 상당)로 쪼갠 후 pan에 넣고 밀봉하여 DSC cell을 제작한다. 이 cell을 DSC에 넣고 25℃∼220℃ 범위에서 열유량을 측정한 뒤 발생한 피크를 적분하여 □H값을 구한다.

결과 및 토론

1. 열변성 BSA Tablet의 제조

BSA를 열변성시킨 결과 제조 pH 3.50, 4.80의 경우 불투명한 gel이, 제조 pH 7.15, 10.0의 경우 투명한 gel이 제조되었다. 이는 pH 3.50, 4.80의 경우 0.5N HCl을 이용하여 pH를 낮추는 과정에서 상당량의 aggregation이 발생한 것과 달리 pH 7.15, 10.0의 경우 aggregation이 거의 발생하지 않았기 때문이다.

2. 팽윤 실험

BSA tablet을 다양한 pH의 인산완충용액에서 팽윤시킨 결과 BSA의 등전점 (pH 4.80) 부근에서 팽윤도가 가장 작았고, pH가 낮아지거나 높아질수록 그 값이 커지는 것으로 나타났다 (Fig. 1). 이는 등전점에서는 BSA 분자의 net charge가 최소가 되고 따라서 열변성된 BSA chain 사이의 정전기적 척력이 최소가 되는데 비해 pH가 등전점보다 낮거나 높을 경우에는 net charge가 증가함으로 인해 정전기적 척력이 증가하기 때문이다.

BSA tablet의 팽윤도를 선형회귀하면 제조시의 pH에 따른 BSA의 pH sensitivity를 근사치로 나타낼 수 있다 (Fig. 2). 더 분명한 비교를 위하여 선형회귀선의 기울기를 BSA tablet의 제조 pH에 대해서 fitting하면 BSA의 제조 pH가 낮아지거나 높아질수록 pH sensitivity가 증가한다는 사실을 알 수 있다 (Fig. 3). 이는 BSA의 제조 pH가 등전점보다 낮아지거나 높아질수록 이온화된 아미노기와 카르복실기의 양이 증가하기 때문이다.

3. DSC 분석

BSA에 대한 DSC 측정 결과 BSA의 제조 pH가 증가할수록 면적이 넓은 열유량 피크가 나타났다 (Fig. 4). 이 피크들을 적분하여 단위질량당의 엔탈피를 구할 수 있었고, 이에 시료의 무게를 곱하여 BSA의 반응열을 구할 수 있었다. 엔탈피값 역시 BSA의 제조 pH가 증가할수록 높아짐을 알 수 있었는데 제조 pH의 증가에 따라서 엔탈피의 증가가 이루어짐을 알 수 있었다. 또한 열류량 피크와 엔탈피값을 통해 BSA의 열변성이 흡열반응이라는 것을 확인할 수 있었다.

결론

BSA 분자의 전하 분포는 BSA 용액의 pH에 따라 달라진다. 따라서 열변성 BSA tablet의 구조 역시 BSA 용액의 pH에 따라 달라지게 된다. 이처럼 제조시의 pH에 의해 결정된 열변성 BSA의 구조는 BSA tablet의 가장 중요한 특성인 팽윤도와 pH sensitivity를 결정하는 요인이 되기 때문에, 제조시 BSA 용액의 pH를 조절함으로써 BSA tablet의 팽윤도와 pH sensitivity를 조절할 수 있다.

BSA tablet의 팽윤도는 BSA의 등전점에서 최소가 되고 등전점보다 팽윤용액의 pH가 낮아지거나 높아질수록 증가하는 추세를 보인다. pH sensitivity 역시 BSA의 등전점에서 최소가 되고 제조 pH가 등전점보다 낮아지거나 높아지면 증가한다. 특히 등전점보다 낮은 pH보다는 높은 pH에서 더 큰 pH sensitivity를 보였다.

DSC에 의한 BSA의 열유량 피크는 제조 pH가 높아질수록 큰 면적을 나타냈으며 따라서 BSA의 엔탈피 또는 반응열 역시 제조 pH가 높아질수록 그 값이 증가하는 경향을 보였다. 그리고 DSC 피크와 엔탈피 또는 반응열의 부호에 의해 BSA의 열변성이 흡열반응인 것이 확인되었다.

Fig. . Degree of Swelling of BSA Tablets

Fig. . Linear Regression of Degree of Swelling

Fig. . pH Sensitivity According to the Denaturation pH of BSA Tablets

Fig. . Heat Flow Peak According to the Denaturation pH of BSA

참고문헌

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