Q Sepharose 음이온 교환막에 의한 유청 단백질의 분리

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

최두영·김정일·선향*·노경호

초정밀분리기술센터, 인하대학교 공과대학 화학공학과

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

*기술표준원, 섬유과

Separation of Whey Protein by Q Sepharose Anion Exchange Membrane

Du Young Choi, Jung Il Kim, Hyang Sun*, Kyung Ho Row

Center for Advanced Bioseparation Technology,

Dept. of Chem. Eng., Inha University, Inchon 402-751, Korea

*Agency for Technology and Standards. MOCIE

서론

치즈 제조 과정에서 나오는 부산물인 유청은 처리가 문제가 되고있다. 하지만, 유청 안에 포함된 단백질과 lactose의 가치에 관심을 갖게되며, 대부분 그냥 버려졌던 유청에 대한 인식이 증대되었다. 유청은 소화 흡수가 빠르고, caseins 보다 필수 아미노산이 풍부하며 영양면에서 유용하다. 또한 유청 단백질은 동물의 면역 조절 작용에 효과적이여서, 암에 대한 저항성을 높이고 심지어는 면역 결핍 바이러스도 억제하는 역할을 하기도 한다[1]. 유청은 가격이 저렴해 세포 배양 배지로 사용하기 쉬울 뿐만 아니라, 몇몇 유청 단백질은 유산균 생장을 향상시키는데 필수적이다[2]. 유청을 구성하는 주요 단백질에는 □-lactalbumin, □-lactogloblin, bovine serum albumin(BSA), immunoglobulins과, 소량의 lactoferrin, lactollin, glycoprotein, 그리고 blood transferrin 등이 존재한다[3]. 유청 단백질의 반을 차지하는 □-lactoglobulin의 단위체 분자량은 18,300 달톤이고, 등전점(pI)은 5.2이다. 보통 pH 3.5-7.5 사이에서는 dimer로 존재한다. □-lactalbumin은 pI는 5.1이고 분자량은 14,000 달톤으로 주로 유아의 소화촉진제로 사용되고 있다. 조직 배양, 진단학에 이용되는bovine serum albumin(BSA)은 분자량이 69,000달톤에 pI가 4.9이다. 유청 단백질은 60℃ 이상의 열에 민감하고 변성 정도는 단백질의 구성, 전체 단백질과 solid의 농도, pH, 이온의 세기, 그리고 온도와 노출시간에 달려 있다[4].

유청의 주요 단백질을 분리하기 위하여 한외여과(ultrafiltration)와 FPLC(fast protein liquid chromatography)등과 같은 기술 연구가 활발히 진행되어 왔다[5]. 본 실험에서 사용된 기술은 HPMC(high performance membrane chromatography)로써 최근 많은 연구가 진행되고 있는 분야이다. 현재 가장 효율적인 HPMC 분리 기술에서 사용하고 있는 membrane의 형태는 미세공 조직을 가진 평막(flat sheet)과 중공사막(hollow fiber), membrane stacks, radial flow cartridge로 분리되고 이들을 고정상으로 사용한다. 분리의 메카니즘은 친화력 상호작용, 이온 교환, 소수성 및 역상 상호작용, 이들은 혼합한 복합기술 등이 있다[6]. HPMC의 분리 메카니즘은 단백질과 염이 음이온 교환막에 경쟁적으로 흡탈착을 반복하면서 분리가 일어나는데 이는 염의 양을 조절하면 분리도를 변화시킬 수 있다. 먼저 단백질이 막에 흡착되고 그 다음에 염을 주입하면 흡착된 단백질 분자는 탈착된다. 즉 단백질의 음전하 정도의 척도라고 할 수 있는 등전점에 차이에 따라 분리가 일어나게 된다[7]. 기존의 HPLC에서 사용하는 컬럼 대신 HPMC에서는 막을 사용함으로써 얻을 수 있는 장점은 유속에 따른 압력의 영향이 적으며 큰 분자량을 가진 단백질과 같은 물질을 분리 할 수 있다는 것이다. 또한 조작이 간편하여 많은 시간을 단축할 수 있고 높은 분리도를 얻을 수 있다. 본 실험에서 사용한 막의 형태는 radial flow cartridge이다.

본 연구의 목적은 강 음이온 교환막인 Q Sepharose를 이용하여, 유청에 포함된 주요 단백질 중 □-lactalbumin, □-lactogloblin과 BSA를 분리조건을 고찰하는 것이다.

실험

1. 실험재료 및 기기

본 실험에 사용된 유청 단백질 및  표준시료인 □-lactalbumin, □-lactogloblin과 bovine serum albumin(BSA), buffer로 사용된 piperazine은 Sigma에서 구입하였으며, buffer B에 포함된 NaCl은 동양화학에서 구입하였다. 물은 2차 증류한 증류수를 사용하였다.

실험에 사용된 column은 amersham pharmacia biotech에서 구입한 HiTrap Q HP(Q Sepharose)이다. 부피 1□인 Q Sepharose는 강 음이온 교환막이다. 분석용 HPLC system으로는 영림과학社의 M930D solvent delivery module, UV 730D detector, 그리고 reodyne 7725i loop injector였다. Centrifuge는 한일社의 MF 550이며, centrifuge membrane은 amicon社의 centriprep YM-10, YM-30(15□)을 사용했다.

2. 실험방법

본 실험에서는 강 음이온 교환막인 Q Sepharose를 고정상으로 사용하였고, 이동상은 buffer A(20 mM piperazine-HCl, pH 6.4)와 buffer B(buffer A + 1M NaCl)를 사용하였다. 표준시료 물질인 □-lactalbumin, □-lactogloblin과 bovine serum albumin(BSA)은 5,000ppm의 농도를 가진 혼합물로 만들어 실험하였다.

유청 단백질은 2차 증류수에 20,000ppm 농도로 용해시킨 후, 목적 단백질인 □-lactalbumin, □-lactogloblin과 bovine serum albumin(BSA)의 분율을 높이고 lactose와 거대 분자 제거를 위해 분자량 한계가 10,000(YM-10)과 30,000(YM-30)의 centrifuge membrane을 사용해 시료를 전처리 하였다. 용해된 시료를 반으로 나누어 담고 centrifuge에서 3,000rpm으로 15분간 조업하였다. 목적 단백질의 분자량이 10,000 이상이기 때문에 분자량 한계 10,000 막을 통과하지 않고 남은 액을 시료로 채취했고, 분자량 한계가 30,000인 막에서는 □-lactalbumin, □-lactogloblin의 분자량이 10,000∼20,000 사이임을 감안하여 막을 통과한 여과액을 시료로 사용했다. 시료 주입량은 20□로 고정하였고 wavelength는 260□, 이동상의 유량은 1□/min으로 실험하였다.

결과 및 고찰

유청 단백질인 □-lactalbumin, □-lactogloblin과 BSA를 분리하기 위하여 기존의 HPLC에 음이온 교환막을 장착하여 실험하였고 구배용매 조성법을 이용하였다. 이는 염의 양을 조절하면서 분리도를 변화시킬 수 있기 때문에 buffer B에 포함된 NaCl의 양을 점점 증가시키는 선형적 구배용매 조성법을 이용하여 단백질을 분리하였다.

Fig. 1은 □-lactalbumin, □-lactogloblin과 BSA 표준 시료 혼합물을 주입하여 분리한 그림이다. 혼합 표준 시료로 여러번 실험한 것 중 효과적이였던 Fig. 1에서는 NaCl의 양을 10∼30 vol.%까지 30분간 천천히 증가시킨 결과 □-lactalbumin은 분리가 됐으나, 등전점 간의 차이가 크지 않은 BSA와 □-lactogloblin은 비슷하게 용출되는 것을 볼 수 있다. 표준 시료에서 얻은 실험 조건을 가지고 유청 단백질 용액에 적용하여 얻은 결과가 Fig. 2와 Fig. 3이다. Fig. 2은 유청 단백질을 물에 20,000ppm 농도로 용해시킨 시료에서 분자량 한계가 10,000인 centrifuge membrane을 통과하지 않고 남은 상등액을 가지고 실험한 그림이다. □-lactogloblin과 BSA의 양이 굉장히 작고, 분리도 역시 낮은 것을 확인 할 수 있다. 같은 농도의 시료를 세공크기 30,000인 centrifuge membrane을 통과한 여과액으로 실험한 Fig. 3은 □-lactogloblin과 BSA가 Fig. 1과 마찬가지로 같이 용출되었다. 하지만 세공 크기 10,000에 비해 거대 분자 제거면에서 효과적이고, Fig. 2에 비해 □-lactalbumin, □-lactogloblin과 BSA의 양이 증가 된 것을 볼 수 있다.

알림

본 연구는 인하대학교 고순도 분리연구실에서 수행하였으며, 기술표준원 산업기반 연구개발의 연구비 지원에 감사드립니다.

참고문헌

1. Mclntosh, G.H., Regester, G.O., Le Leu, R.K., Royle, P.J. and Smithers, G.W., J. Nutr., 125, 809 (1995)

2. D. Bury, P. Jelen and K. Kimura, Dairy Journal, 8, 149 (1998)

3. S.J. Gerberding, C.H. Byers, J. of Chromatogr. A, 808, 141 (1998)

4. Heiner Splitt, Ina Mackenstedt, Ruth Freitag, J. of Chromatogr A, 729, 87 (1996)

5. Arabelle Muller, Georges Daufin,Bernard Chaufer, J. of Membrane Science, 153, 9 (1999)

6. Xianfang Zeng, Eli Ruckenstein, Biotechnol. Prog., 15, 1003 (1999)

7. D.K. Roper, E.N. Lightfoot, J. of Chromatogr. A, 702 3 (1995)

Fig. 1 Separation of standard mixture by Q Sepharose anion exchanger

(Buffer A/Buffer B(vol.%) = 95/5-90/10 for 5 min, 90/10-90/10 for 5 min, 90/10-70/30 for 35 min, 70/30-70/30 for 10 min, 70/30-10/90 for 5 min, flow rate 1ml/min, UV wavelength at 260nm)

Fig. 2 Separation of whey protein by Q Sepharose anion exchanger

(Buffer A/Buffer B(vol.%) = 95/5-90/10 for 5 min, 90/10-90/10 for 5 min, 90/10-70/30 for 35 min, 70/30-70/30 for 10 min, 70/30-10/90 for 5 min, pore size 10,000 ultracentrifuge membrane retentated)

Fig. 3 Separation of whey protein by Q Sepharose anion exchanger

(Buffer A/Buffer B(vol.%) = 95/5-90/10 for 5 min, 90/10-90/10 for 5 min, 90/10-70/30 for 35 min, 70/30-70/30 for 10 min, 70/30-10/90 for 5 min, pore size 30,000 ultracentrifuge membrane permeated)

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년