Surface Plasmon Resonance의 분자인식기법을 이용한

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

고체상 재접힘 단백질의 활성 정량평가 개발

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

서창우, 나세진, 황상연, 최원찬, 이은규↕

한양대학교 화학공학과 생물공정연구실

Monitoring of Unfolding and Refolding of Immobilized Proteins

Using Surface Plasmon Resonance Sensor

Chang Woo Suh, Se Jin Na, Sang Youn Hwang, Won Chan Choi,

and Eun Kyu Lee↕

Bioprocessing Research Laboratory, Department of Chemical Engineering, Hanyang University, Ansan, 425-791 Korea

서론

재조합 대장균 유래 내포체로부터 유용 재조합 단백질을 얻는 생산 공정은 산업적으로 널리 이용되고 있다.  이 공정의 큰 문제점은 내포체를 용해시킨 후 재접힘(refolding)을 통해 native 단백질을 얻는 과정의 수율이 일반적으로 매우 낮다는 것이다. 이 문제점을 해결하기 위하여 고체상 재접힘(solid-phase refolding) 공정을 도입하여 수율을 향상시키고 공정 부피를 단축시키는 연구들이 보고되고 있다.

기존의 액상에서의 재접힘 공정에 대한 모니터링 방법으로 CD(circular dichroism) 분석을 통한 2차 구조의 변화 측정, RP-HPLC를 이용한 표면 소수성의 변화 측정, 3차 구조 형성에 따른 생물학적 활성(bioactivity) 측정, ANS(1-anilinonaphthalent-8-sulfonate) 등의 형광 라벨을 이용한 표면 소수성 변화 측정 등이 있다.  그러나 고체 담체 등의 고체 표면에 고정화된 단백질의 재접힘 현상을 모니터링 하는 방법은 지금까지 전무하였다. Sepharose 등 담체 표면에 고정화된 단백질의 구조 변화를 직접 CD 분석을 통하여 유추하는 방법도 보고된바 있지만 사용하는 담체에 따라 측정상의 많은 오차가 있어 적용의 한계가 있다. 따라서 고체상에 고정화된 단백질의 재접힘에 대한 모니터링을 위하여 우리는 새로운 분석법을 도입하여야만 한다.

SPR(surface plasmon resonance) 센서는 단백질과 단백질 또는 단백질과 DNA의 상호작용을 연구하는데 널리 사용되고 있다.  이것의 원리는 센서 칩 표면에 고정화된 ligand 물질에 분석하고자 하는 물질이 결합할 때 질량의 변화를 감지하는 것으로 분자 인식에 의한 결합 반응의 속도론적인 연구와 미량의 시료에 대한 반응 측정이 가능하다. 고정화 단백질의 재접힘 과정에서 단백질의 소수성 잔기와 친수성 잔기의 3차원적 위치가 변화함으로써 단백질의 유전율(dielectricity)이 변화하게 되고, 이러한 유전율의 변화를 SPR의 신호로 감지하여 고정화 단백질의 접힘과 풀림 상태를 유추할 수 있다는 이론이 제시되었다.  Maxwell 방정식 (□ = n2, □은 유전상수(dielectric constant), n은 굴절율(refractive index))에서 단백질의 구조 변화에 의한 유전율의 변화는 refractive index의 변화를 초래하고 이 refractive index를 SPR로 측정할 수 있는 것이다.

본 연구에서는 SPR을 이용한 재접힘 모니터링 연구에서 보다 체계적인 실험을 통해 고체상에 고정화된 단백질의 구조 변화를 측정하고자 하였다.  Urea와 GuHCl 등 변성제의 농도의 영향과 환원제인 DTT(dithiothreitol) 처리 전후의 차이를 비교하였다.  또한 이황화결합이 12개인 urokinase와 전혀 없는 myoglobin의 재접힘 과정을 SPR로 모니터링 함으로써 이황화결합이 재접힘 과정에 미치는 영향을 분석하였다. 또한 GST(glutathione S transferase)와 anti-GST 항체의 결합 반응을 대상으로 재접힘 과정에 의해 생물학적 활성이 얻어지는 것을 정량적으로 분석하여 재접힘 과정을 모니터링하는 실험을 수행하였다.

본론

센서칩 상에 단백질 고정화

센서 칩 상에 단백질을 고정화하기 위한 최적 pH 조건을 찾는 preconcentration 실험을 통해 anti-GST는 pH 4, 유로키나제는 pH 6, myoglobin은 pH 5가 최적이였다.  센서 칩 상의 사용가능한 4개의 유로에서 첫 번째 유로는 대조 유로(reference flow cell)로 사용하였고 나머지 유로에 단백질을 고정화하였으며 대조 유로의 측정값과 단백질이 고정화된 유로에서의 측정값의 차이를 이용하여 고정화 정도를 계산하였다. 단위는 resonance unit (RU)를 사용하고, 1000 RU의 변화는 1 ng/□2 (0.1 SPR angle 변화)의 질량 변화를 의미한다. Anti-GST는 13,000 RU가 고정화되었으며 유로키나제는 4,599 RU가 고정화되었고 myoglobin은 525.4 RU가 고정화되었다.

변성제 농도에 따른 풀림 정도의 정량적 평가

우리는 고정화된 단백질의 구조 변화 시 단백질의 유전율의 변화를 가져오고 이것이 공명각의 변화를 가져온다는 것에서부터 출발하였다.  변성제를 처리하여 풀림 과정을 진행하게되면 단백질은 소수성 잔기들이 표면으로 나오기 때문에 native한 구조상에서 친수성 잔기들이 표면에 있고 소수성 잔기들이 내부에 있는 경우와는 다른 유전율을 가져오게 된다.  이것이 refractive index의 감소를 일으키고 이러한 refractive index 값의 변화가 SPR의 공명각의 감소(RU)로 관측되어진다(Figure 1.).

우리는 변성제의 농도에 따른 RU 값의 변화를 수 차례 반복 실험을 통해 그 재현성을 확인하였으며, 변성제를 제거한 후에 RU 값이 초기 값 대비 10 RU 이내로 모두 회복함을 확인하였다. 변성제의 농도에 따라 유로키나제와 Anti-GST의 RU 값의 변화를 측정하였다. 그림 2에 따르면 urea와 GuHCl에 대해서 모두 변성제의 농도가 증가할수록 RU 값은 감소함을 알 수 있다. 이는 Anti-GST와 유로키나제에 대해서 같은 경향을 나타내고 있다. urea의 경우 7M 이상의 농도에서는 대조 유로의 RU 값이 흔들리기 때문에 결과에서 제외하였다. 이로써 우리는 변성제의 농도를 증가할수록 단백질은 더 풀림상태로 가고 그에 따라서 RU 값이 더 감소한다는 것을 관측하였다. 물론 각 단백질의 고정화된 밀도가 다르기 때문에 두 단백질의 풀림 정도를 정량적으로 비교할 수는 없으나 단백질과 변성제의 종류에 상관없이 변성제의 농도에 따라서 단백질의 풀림 정도가 RU 값의 감소로 관측된다는 것을 알 수 있다. 특이적으로 GuHCl을 사용한 유로키나제의 풀림 결과에서 5M와 6M에서 RU 값의 변화가 없는 것이 관측되었다. 우리는 이러한 결과가 유로키나제가 5M GuHCl에서 충분히 풀렸기 때문에 더 이상의 RU 값의 변화가 없었다고 생각하였다.  Urea의 경우 Anti-GST와 유로키나제에 대해서 변성제의 농도가 증가함에 따라서 RU 값의 감소가 비슷한 경향을 나타내고 있다.

환원제 처리 후 단백질의 구조변화

앞선 실험에서 변성제의 의해서 단백질이 풀리고 변성제를 제거함으로써 재접힘이 일어난다는 것을 SPR의 RU 값의 변화로부터 측정하였다. 우리는 여기에서 만일 재접힘 공정에서 단백질이 native한 3차원적인 구조로 돌아오지 못한 경우에는 SPR상에서 어떻게 측정될지에 대한 실험을 수행하였다. 이를 위해서 이황화결합의 수가 12개인 유로키나제와 이황화결합이 전혀 없는 단지 □-helix 구조로만 이루어진 myoglobin을 대상으로 실험을 수행하였다.  즉 이황화결합이 있는 유로키나제의 경우 환원제인 DTT와 변성제인 urea를 함께 주입시켜서 단백질의 풀림을 일으키고 환원제와 변성제를 제거함으로 재접힘을 유도하였다. 이때 이황화결합이 많은 유로키나제의 경우 native한 형태로 돌아올 확률이 매우 낮기 때문에 분명 RU값의 변화가 다르게 나타날 것이며 myoglobin의 경우 이황화결합이 없기 때문에 재접힘 후 RU 값은 원래 상태로 회복될 것이다.

이러한 가정에서 출발한 실험에서 우리는 Figure 3(a)와 같은 결과를 얻었다. 이 그림에 따르면 유로키나제의 경우 DTT 처리하지 않은 경우는 원래 상태의 RU 값을 회복하였지만 DTT 처리한 경우는 초기 RU 값의 70±5% 정도만이 회복되었다. 이는 2회 반복한 실험에서 얻어진 결과이다. 또한 Figure 3(b)에서 이황화결합이 없는 myoglobin의 경우 DTT 처리 후의 RU 값이 초기 값으로 완전 회복됨을 알 수 있었다.  물론 이러한 실험을 위해 대조 유로는 DTT의 영향을 받지 않는다는 것을 실험을 통해 확인하였다.  그리고 단백질이 풀림 상태에서 같은 urea 농도 하에서는 DTT 첨가 전후의 RU 값의 변화는 미비하여 무시할 수 있는 수치임을 확인하였다. 즉 DTT는 SPR 측정에 아무런 영향이 없음을 확인하였다.

우리는 이 실험결과를 통해서 SPR상에서 RU 값의 변화가 단백질의 재접힘 공정에서의 구조변화를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한 재접힘 공정에서 RU 값의 회복 정도에 따라서 재접힘 수율을 간단하게 측정할 수 있는 기술을 얻게 되었다. 또한 100 □L 이하인 미량의 시료만으로도 라벨링 반응 없이 수 분 내에 재접힘 공정에 필요한 최적화된 조건을 찾는 실험을 수행할 수 있다.

단백질의 풀림 정도와 생물학적 활성과의 상관관계

단백질의 풀림 정도와 생물학적 활성을 직접 비교하기 위해서 anti-GST와 GST의 결합을 여러 농도의 urea에서 실험하였다.  Figure 4에서 변성제의 농도에 따른 anti-GST의 RU 값 감소와 anti-GST와 GST의 결합정도를 비교해보면 매우 유사한 경향을 가지는 것을 알 수 있다.  변성제의 농도가 증가할수록 anti-GST와 GST의 결합정도가 낮아지며 또한 anti-GST의 RU 값도 감소한다는 것을 보여주고 있다. 즉 변성제에 의한 RU 값의 감소는 단백질의 구조 변화 뿐만 아니라 단백질의 활성의 감소와도 연관된다는 것을 보여주고 있다. 우리는 이러한 실험 결과를 통해 변성제에 의한 단백질의 구조변화를 RU 값 측정을 통해 정량화할 수 있다는 근거를 제시하였다.

위 실험에서 우리는 변성제 존재 하에 anti-GST와 GST간의 결합 정도의 차이가 생기는 것이 anti-GST가 변성제에 의해 풀림으로써 활성이 감소를 확인하였지만, 변성제를 제거한 후에 RU 값이 초기 상태로 회복되었을 경우에 센서 칩 상에서 단백질의 재접힘에 의해 본래의 3차원적 구조와 활성을 회복한다는 것을 증명하기 위해서 변성제 처리 전후의 anti-GST와 GST의 결합정도를 SPR 상에서 실시간으로 측정하였다.  Figure 6은 anti-GST를 여러 농도의 urea로 풀림/재접힘을 수행한 후에 GST와의 결합 정도를 측정한 것이다.  이 결과에 따르면 urea 처리 전에 GST가 800±10 RU로 결합하였고 urea 처리 후에 농도에 따라서 2 M일 때 812 RU, 4 M일 때 793 RU, 6 M일 때 750 RU의 값으로 결합하였다.  즉 변성제 처리 후에도 결합력에는 큰 변화가 없다는 것을 알 수 있었다.  즉 센서 칩 상에서 풀림과 재접힘이 일어나서 RU 값이 본래의 값으로 회복되었을 경우 본래의 3차원적 구조가 형성되어 생물학적 활성을 회복한다는 것을 보여주고 있다.

유로키나제의 경우 센서 칩 표면에 고정화된 효소 활성의 측정이 기존의 효소 활성 측정방법으로는 불가능하여 Guisan 팀에서 chymotrypsin을 Sepharose 겔에 고정화시킨 후 urea와 GuHCl의 각각의 농도에서 효소의 활성을 측정한 결과와 유로키나제의 센서 칩 상에서 변성제 처리 시의 RU 값과 비교하였다.  Figure 5에 따르면 urea의 농도에 따른 유로키나제의 RU 값의 감소 현상과 chymotrypsin의 효소 활성의 감소 경향이 매우 유사함을 볼 수 있다.  또한 GuHCl로 처리한 경우에는 조금 차이를 보이기는 하나 유사한 감소 현상이 관찰되고 있다.  물론 대상 단백질이 다르기 때문에 정확한 비교라고 할 수는 없으나 상대적인 비교 데이타로 RU 값과 효소의 활성과의 관계를 규명하는 중요한 결과라고 생각된다.  실제로 유로키나제를 6 M GuHCl로 처리한 후에 활성을 측정한 경우 효소 활성은 전혀 없는 것으로 발표되었다.

결론

고체상에 고정화된 단백질에 대한 풀림/재접힘 공정의 모니터링에서 SPR을 이용하여 성공적으로 정량화 할 수 있는 방법을 제시하였다.  이러한 방법은 고정화된 단백질의 재접힘공정의 모니터링을 위한 유일한 방법이며 생물학적 활성과의 비교를 통해 논리적인 근거를 제시하였다. 그러나 이러한 센서 칩 상에서 단백질의 풀림과 재접힘을 모니터링 하는 실험에서 풀림 정도에 따른 단백질의 생물학적 활성을 측정한다는 것이 대부분의 단백질에서는 어렵거나 불가능한 문제가 있다.  본 연구 방법은 아주 빠른 시간에 적은 시료만으로 실험을 수행할 수 있기 때문에 고체상 재접힘 (solid-phase refolding) 공정의 최적 조건을 찾는 방법으로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

감사

본 연구는 차세대신기술개발사업의 연구비 지원에 감사 드립니다. 또한 인하대학교 초정밀생물분리기술연구센터(ERC)의 일부 연구비 지원에도 감사 드립니다.