조작온도 범위를 고려한 SBH용 probe의 특성 및

반응 조건에 대한 연구

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

제갈성준, 문일□

연세대학교 화학공학과

Analysis of the Properties and the Hybridization Conditions of Probes

Considering Operating Temperature Range for SBH

Sungjoon Chegal and Il Moon□

Department of Chemical Engineering, Yonsei University

서론

DNA chip(또는 DNA microarray)은 각종 생명체가 가지고 있는 방대한 양의 유전정보를 빠른 시간에 대량으로 분석, 처리할 수 있는 신기술이자 현재의 Genomics 열풍을 가능하게 하는 강력한 무기라 할 수 있다[1,2]. DNA chip은 짧은 시간에 많은 양의 정보를 나타낼 수 있으며 자동화가 용이하기 때문에 이를 이용한 많은 기술들이 개발되었는데 그 중 하나가 Sequencing By Hybridization (SBH)이다[3]. 이는 DNA chip 위에 부착된 대량의 probe를 이용하여 동시에 hybridization을 실행하므로서 빠른 염기서열 분석을 가능하게 해준다. Hybridization을 이용한 조작에서 probe와 target DNA의 정상적인 결합을 유지하는 가장 중요한 요소는 반응온도이다. 각 probe와 결합해 있는 target DNA는 서로 결합해 있는 염기의 종류에 따라 결합도가 다르고 이에 따라 hybridization이 안정한 상태를 유지하는 조작온도 범위(Operating Temperature Range, OTR)가 달라지게 된다. 이 조작온도 범위는 모든 probe에 대하여 일정한 범위를 유지해야 한다. 이를 위해서는 probe의 특성 및 반응 조건을 분석하여 probe의 적절한 선택이 필요하게 된다. 본 연구에서는 SBH의 과정에서 필요한 probe를 결정함에 있어서 조작온도 범위를 고려하는 방안을 제시하였다.

본론

1. DNA Chip

DNA chip은 아주 적은 양의 유전물질을 유리슬라이드와 같은 고형체 위에 고밀도로 붙여서 서로 상보적인 서열을 가지고 있는 DNA 조각을 검색할 수 있는 기법이다[4].  DNA chip의 이용분야는 유전자 발현분석과 유전자 염기서열분석 분야로 나뉠 수 있다(Fig. 1)[5]. 다양한 성장 조건하에서의 세포 내 유전자들의 발현형태를 비교함으로서 유전자간 상호 연관성을 규명하려는 것이 유전자 발현 분석이다. 염기서열분석은 돌연변이의 검색이나 대규모 서열분석 사업을 말하는데 이 분야에는 원래 DNA chip을 이용한 방법외에도 다른 여러 가지 기술이 있었으나 기존의 서열분석 기술은 시간과 비용을 많이 필요로 하는 단점으로 현재는 oligonucleotide chip을 이용한 sequencing 기술이 개발되고 있다. 이렇게 DNA chip을 이용한 서열분석 기법을 Sequencing By Hybridization이라고 한다.

2. Sequencing By Hybridization (SBH)

SBH는 염기서열을 전혀 모르는 DNA fragment의 염기서열을 알아내는 unknown-sequence sequencing과 알고있는 염기서열의 mutation을 찾아내는 resequencing이 있다. unknown-sequence sequencing의 경우, 알고자 하는 DNA fragment의 염기 개수가 n개이면 총 4n개의 probe를 슬라이드 위에 고정시키고 실험하여야 한다[6]. 이때 얻어지는 hybridization 결과를 조합하여 서열을 결정하게 된다(Fig. 2). 한편 이미 알고 있는 염기서열에 대한 resequencing 기술은 돌연변이에 의한 염기서열 하나의 변화인 point mutation을 찾아내는 방법이다. resequencing에서는 이미 알고 있는 target DNA의 염기서열정보를 토대로 길이 8-30 bp 의 probe set을 설계하고 이를 부착한 oligonucleotide DNA chip을 사용하게 되는데 이때 probe의 설계에 영향을 주는 것들로는 probe의 길이, G+C의 fraction, melting temperature 등이 있다. 이 3가지 요소는 서로 연관성을 가지고 있는데 이 중 melting temperature가 가장 중요한 요소이다.

Fig. 1. DNA chip의 응용 [5]

3. Melting Temperature

Fig. 2. Sequencing By Hybridization [5]

Hybridization에 의한 probe와 target DNA의 결합은 수소결합에 의해 이루어지게 된다. A와 T의 경우 2개의 수소결합으로 연결되며 G와 C는 3개의 수소결합으로 연결된다. 따라서 Hybridization이 일어난 염기들 중에 G/C의 결합이 많을수록 이 결합은 stability가 높아지게 된다. 반대로 A/T의 결합이 많을수록 그 결합은 쉽게 떨어지게 된다. 즉 probe의 서열에 따라서 target DNA와의 결합 안정성이 변하게 된다. 이러한 물리화학적인 안정성을 나타내는 척도로 Melting Temperature(Tm)를 사용한다. probe와 target DNA는 Tm 이상의 온도에서는 결합이 떨어지게 되고 Tm 이하의 온도에서는 다시 결합하게 된다. Tm을 계산하는 방법은 여러 가지 수식으로 나타낼 수 있다.

Tm = 81.5 + 16.6 log[Na+] + 41 (mole fraction G + C) - (500/length of oligonucleotide)   (1)

Tm = 79.8 + 18.5 log[Na+] + 58.4 (mole fraction G + C) + 11.8((mole fraction G +C)2)

- (820/length of oligonucleotide)	(2)

4. Operating Temperature Range(OTR)

반면에 너무 온도가 낮을 경우 probe와 target DNA가 서로 결합할 수 없는 서열을 가지고 있더라도 hybridization이 일어나게 될 수 있다. 이러한 miss-match의 경우 어느 정도 온도를 높혀 miss-match 간의 결합을 떨어트려야 하는데 이 때의 최저 온도를 Td라고 하면 Tm∼Td 간의 범위를 OTR이라고 한다(Fig. 3). 일반적인 DNA chip 실험에서 Na+의 농도를 2M 정도로 사용하고 있으며 G+C의 fraction을 0.5라고 가정하면 식 (2)를 이용해서 Tm―Td을 계산할 수 있으며 이를 도식하면 (Fig. 4)와 같다. 예상하는 바와 같이 probe의 길이가 길어질수록 OTR은 감소하는 것을 확인할 수 있다. 또한 probe가 25bp 이상이 되면 OTR의 값은 Hybridization 여부를 확인할 수 있는 최소값인 2oC [7]보다 낮은 범위를 갖게되어 실제적인 효용성이 없음을 확인할 수 있다. 따라서 이와 같은 조건에서의 실험에서는 probe의 선택에 있어 25bp이하의 길이를 가진 것들만 사용해야 한다.

Fig. 4. Operating Temperature Range vs. probe length

Fig. 3. Operating Temperature Range

결론

DNA chip에 사용되는 probe는 그 길이와 염기서열에 의해 각각의 Operating Temperature Range를 갖게 된다. 또한 Hybridization 반응은 한번에 수천개의 probe를 대상으로 진행되기 때문에 전체 probe는 동일한 온도조건에서 반응에 참여하게 된다. 이 온도조건이 몇몇의 probe의 OTR을 벗어나는 조건이라면 이 probe는 정상적인 결과를 보여주지 못하게 된다. 따라서 probe의 설계초기부터 probe와 target DNA 간의 Melting Temperature를 고려한 작업이 필요시 된다. 결국 최적화된 probe set을 이용하면 모든 probe의 OTR에 포함될 수 있는 전체 DNA chip의 OTR을 얻을 수 있게 된다(Fig. 5).

참고문헌

Fig. . DNA chip Operating Temperature Range

1. 이상엽, 윤성호, 임근배, 조윤경, "Gnomics와 DNA chip", News & Information for Chemical Engineers, 18, 3, 307-311 (2000).

2. S.J. Watson, et al.,"The "Chip" as a Specific Genetic Tool", Biological Psychiatry, 48, 1147-1156 (2000).

3. R. Drmanac, et al., "DNA Sequence Determination by Hybridization: A Strategy for Efficient Large-Scale Sequencing", Science, 260, 5114, 1649-1652 (1993).

4. 황승용, "DNA chip을 이용한 Functional Genomics", Biochemistry News, 19, 2 (1999).

5. D.J. Graves, "Powerful tools for genetic analysis come of age", TIBTECH March 1999, 17 (1999).

6. P.A. Pevzner, "Computational Molecular Biology, An Algorithmic Approach", MIT Press (2000).

7. W. Bains, "Selection of Oligonucleotide Probes and Experimental Conditions for Multiplex Hybridization Experiments", Genetic Analysis: Techniques and Applications, 11, 3, 49-62 (1994)

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년