광학측정시스템을 이용한 유기인화합물의 측정

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2001년

김종민, 김영기, 최정우, 이원홍

서강대학교 화학공학과

Detection of Organophosphorus Compound by Optical Detection System

Jong-Min Kim, Young-Kee Kim, Jeong-Woo Choi, and Won Hong Lee

Department of Chemical Engineering, Sogang University

서론

유기인화합물은 사람의 신경세포내의 필수효소인 acetylcholinesterase (AChE)를 저해하는 강한 신경독성물질로 알려져 있다. 이러한 유기인화합물은 농업 및 군사용 생화학무기로 사용되며, 특히 농약 및 살충제에 다량포함 되어 있어 환경오염을 유발할 수 있다. 따라서 유기인화합물을 측정하기 위한 센서에 대한 연구가 최근 활발히 수행되어 보고되고 있다(1-4). 기존의 유기인화합물 센서의 측정원리는 AChE에 의한 효소반응이 유기인화합물에 의해 저해되는 것을 이용한 것으로 Clark electrode를 이용하거나 quartz crystal microbalance를 이용하는 방법이 주로 사용 되어왔다. 이런 센서들은 전기적 신호처리장치를 이용하기 때문에 신호간섭 등의 문제점이 지적되어 왔다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 AChE 효소반응이 유기인화합물에 의해 저해되는 반응을 광학적으로 측정하는 센서시스템에 대한 연구가 이루어졌다(5-7). 하지만 광학적 신호전달장치를 이용한 광바이오센서의 상용화에 대한 연구는 미진하였으며 본 연구에서는 유기인 화합물을 분석할 수 있는 상업화가 가능한 소형화된 광섬유바이오센서를 제작하였다.

Paraoxon, parathion 등의 유기인화합물들은 신경전달물질인 acetylcholine을 acetate와 choline으로 가수분해시키는 효소인 AChE의 반응을 저해하는 물질이다(8-9). 본 연구에서는 유기인화합물로 paraoxon(diethyl p-nitrophenyl phosphate)을 사용하여 AChE가 기질인 acetylthiocholine iodide와 반응할 때 paraoxon이 효소-기질 반응을 저해하는 정도를 측정하였다. 이 반응의 저해 정도를 광학적으로 측정하기 위해 효소-기질 반응의 부산물인 아세트산에 민감하게 반응하는 지시약인 litmus를 사용하여 아세트산의 생성량을 광학적으로 측정하였다. 아세트산의 최대 흡수파장대는 204nm의 근자외선 영역이며, 이 파장대 영역은 저가의 광학적 장치로는 측정이 어렵다. 따라서 본 연구에서는 아세트산에 의하여 최대 흡수파장대의 변화가 일어나는 지시약인 litmus의 흡광도를 측정하여 유기인화합물에 의한 효소-기질 반응의 저해정도를 간접적으로 측정하였다. 유기인화합물인 paraoxon이 저해제로 작용하여 AChE와 기질의 반응을 저해하면 생성물 아세트산의 양이 감소하며, 이에 따른 litmus의 흡광도 변화를 측정하여 저해정도를 분석할 수 있다. 흡광도의 차이는 광섬유를 통하여 광 다이오드에 의해 전기적 신호로 변환되었다.

재료 및 방법

효소로는 acetylcholinesterase(EC 3.1.1.7:V-S, from eletric eel), 기질로는 acetylyhiocholine iodide, 그리고 저해제로는 diethyl-p-nitrophenyl phosphate(95%, paraoxon)를 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다. 아세트산 생성량을 측정하기 위한 지시약인 litmus도 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 사용하였으며, litmus의 반응 pH 범위는 AChE 반응의 최적 pH인 중성영역에 속하며 최대 흡수 파장대는 580 nm로 측정이 용이하여 저가의 측정장비로 측정 가능한 장점이 있다.

측정원리 및 실험방법

Thiocholine과 acetic acid의 ester화합물인 acetylthiocholine iodide는 AChE와 반응하면 choline의 암모니움은 anionic site에, 아세트산의 탄소는 esteratic site에 결합한다. 그리고 serine의 수산화기로부터 수소원자가 histidine의 질소로 옮겨가고, serine의 산소는 아세트산의 탄소와 공유결합을 이룬다. 마지막으로, AChE의 ester bond가 끊어지면서 AChE의 histidine으로부터 수소원자를 얻은 choline이 독립된 분자로 떨어져 나간다. 이때 생성된 아세트산으로 인해 sample의 pH가 변화하므로 litmus 고유 흡수파장의 흡광도 변화가 발생한다.

AChE

Acetylthiocholine iodide + H2O -----------> thiocholine + acetic acid    식(1)

pH 변화에 의한 흡광도 변화를 측정하는 실험이기 때문에 실험에 사용된 시료 및 모든 시약은 pH 7.0으로 조절하여 사용하였고 AChE의 최적반응온도인 25℃에서 실험을 수행하였다(8). 1 mM acetylyhiocholine iodide : litmus용액 : AChE(20unit)의 비율은 1:1:1로 하여 paraoxon농도 0, 0.5, 1, 1.5, 2ppm에 대하여 2분의 반응시간 후 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 UV-visible spectroscopy (V300, JASCO, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.

광바이오센서 제작

Litmus의 최대 흡수파장은 pH 4.5∼8.3의 범위에서 580nm이며 이 파장에서의 흡광도를 측정하기 위한 광원으로는 585nm에서 최대 광세기를 가지는 고휘도 발광다이오드를 사용하였다. 흡광도를 측정하기 위한 장치로는 저전압, 초소형 실리콘 PIN형 광다이오드(Model 818-BB-40, Newport, USA)를 사용하였다. 광다이오드에 의해 변환된 전기적 신호는 소형 Multimeter (Fluke 189, Everett, WA, USA)를 사용하여 정량화하였다. 본 연구에서 제작된 유기인화합물 측정을 위한 광바이오센서의 개략도를 Figure 1에 나타내었다.

결과 및 고찰

pH 변화에 의한 litmus 용액의 흡광도 변화

본 연구에서는 AChE 반응의 부산물로 생성되는 아세트산에 의한 pH 변화를 지시약의 색변화로 측정하여 AChE의 반응도를 분석하는 방법을 사용하였다. 따라서, pH 변화에 따른 litmus 용액의 흡광도 변화를 검증하기 위해 phosphoric acid에 의하여 pH 7로 buffering된 0.1 mM litmus수용액의 흡광도 곡선과 여기에 아세트산 50 mM을 용해시킨 경우의 흡광도 곡선을 Figure 2에 비교하여 보았다. 0.1 mM litmus수용액의 흡광도 곡선에서 최대흡수파장이 580nm에 존재함을 관찰하였고, 아세트산에 의해 산성화된 경우 580 nm의 흡광도가 감소하고 최대흡수파장이 500 nm로 이동됨을 확인하였다. 일반적으로 산과 반응하여 산화된 물질은 고유의 흡수파장대가 자외선 영역으로 이동하게 되며, litmus의 경우 아세트산과 반응하여 산화가 진행되면 고유의 흡수파장인 580 nm의 흡광도가 감소하고 500nm에서 산화된 형태의 흡수파장대가 관찰되는 것을 볼 수 있었다.  본 연구에서는 AChE 효소반응도를 측정하기 위하여 효소반응의 부산물인 아세트산의 생성량을 측정하였으며 아세트산의 생성량은 아세트산에 의한 중성 litmus용액의 고유 흡수파장인 580 nm의 흡광도 감소 측정을 통하여 얻었다.

효소반응에 따른 litmus 용액의 흡광도 변화

효소반응을 통하여 생성되는 아세트산에 의해 litmus 수용액의 흡광도가  580 nm에서 감소하고 500 nm에서 litmus 산화물의 흡광도가 증가하는 것을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 효소반응을 위하여 AChE 효소는 20 unit를 사용하였으며 1 mM acetylyhiocholine iodide 기질, 0.2 mM litmus 용액을 이용하여 실험을 수행하였다. 실험결과를 나타낸 Figure 3을 보면 AChE를 첨가하여 반응을 시작하기 전의 흡광도 곡선에서 580 nm의 흡광대를 관찰하였으며 효소를 첨가하여 2분이 경과한 후의 흡광도곡선에서는 580 nm의 흡광도가 감소하고 500 nm 파장대의 흡광도가 증가하는 것을 확인하였다. 이로부터 효소 반응정도를 580 nm 파장대의 흡광도를 측정하므로써 예측하는 것이 가능함을 확인할 수 있었다.

광바이오센서를 이용한 paraoxon 농도 측정

제작된 광바이오센서 시제품을 이용하여 0, 0.5, 1, 1.5, 2ppm의 paraoxon 농도에서 측정된 센서 신호를 Figure 4에 나타내었다. Paraoxon의 농도가 증가할수록 효소 반응의 저해정도가 증가되고 이에 따라 생산물인 아세트산이 적게 나옴으로써 중성의 litmus가 가지는 최대흡수파장인 580 nm의 흡광도가 커서 센서의 신호가 작아지는 것을 확인하였다. 또한 센서 신호가 실험에서 사용된 측정범위인 0ppm에서 2 ppm 사이에서 농도에 따라 선형적 감소를 보임으로써 제작된 광바이오센서를 사용한 유기인화합물의 정량적 분석이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

참고문헌

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