기포탑 Xanthan 발효에서의 산소공급 향상 위한

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

과산화수소 또는 유동입자의 이용

노희찬, 서일순

건국대학교 화학공학과

Use of Hydrogen Peroxide and Fluidized Particles

for Improving the Oxygen Supply of Xanthan Fermentations

in Bubble Columns:

H. C. Roh, I.-S. Suh

Department of Chemical Engineering, Konkuk University

서론

Xanthan은 대표적인 세포외 다당류 중 하나이다. 물에 잘 녹으며 적은 양으로 높은 점도를 얻을 수 있고 수용액은 강한 가소성, 항복응력 및 탄성 등 복잡한 유변학적 특성을 나타낸다. 이러한 유변학적 성질은 온도, pH, 염도 등의 변화에 거의 영향을 받지 않아 식품, 의약품, 화장품 및 화학산업에서 유화제, 안정제, 윤활제, 응고제 등으로 널리 사용되고 있다(1). 산업적으로 xanthan은 절대 호기성 박테리아인 Xanthomonas campestris를 이용하여 100 m3 이상의 대형 교반식 반응기에서 회분식으로 생산되고 있다. 앞서 언급한 xanthan 수용액의 독특한 유변학적 특성은 생물반응기의 기-액 산소전달, 혼합 및 열전달 등의 성능을 저하시킨다. 따라서 일반적으로 사용되는 교반식 반응기에서는 교반기로부터 멀리 떨어진 반응기 벽 부근 등에 정체구역이 형성되어 반응기 유효부피 및 균의 생성물 비생산성은 감소한다(2). 이러한 문제를 피하기 위하여 교반기와 반응기의 직경비가 비교적 큰 특수한 교반기를 채용하여 대량의 에너지를 투입한다. 이에 반해 기포탑은 높은 xanthan 농도의 고점도에서 형성되는 탑 단면을 거의 채우는 기포 슬러그 후류의 작용으로 인해서 좋은 혼합특성을 나타낸다(3). 기포 슬러그는 낮은 단위부피 당 기-액 접촉면적을 유발하나 기포탑 반응기는 높은 산소흡수효율을 나타낸다(4). 회분식 xanthan 발효에서 비교적 높은 xanthan 농도를 나타내는 정상상태에서 균체 단위질량 당 xanthan 생성속도와 생성되는 xanthan 분자량은 산소전달속도에 비례한다(3, 5, 6).

고점도 발효에서 산소전달속도를 증가시키기 위하여 여러 방법을 사용할 수 있다. 우선, 반응기 내에 기계적 교반기를 사용하지 않는 탑형 생물반응기에서 크기가 크고 밀도가 높은 유동화입자는 기포를 분쇄하는 효과를 나타낸다. 기포분쇄효과는 기-액 접촉면적을 증가시켜서 단위부피 당 기-액 물질전달계수를 증가시킨다. 직경 8 mm 유리구슬을 유동화입자로 사용할 경우 고점도 xanthan 수용액에서도 기포탑 반응기에 비하여 높은 기-액 산소전달속도를 보였다(4). 그리고, catalase 효소(E)를 이용한 과산화수소 분해를 통한 산소공급의 적용을 생각할 수 있다(7):

[eqn: rmE+H_2 O_2 ~->~ EO+H_2 O]

()

[eqn: rmEO+H_2 O_2 ~->~ E+O_2 +H_2 O]

()

대부분 호기성 균체는 세포 내 대사작용의 결과로 생성되는 독성 과산화수소를 분해하는 catalase를 함유하고 있다. Sriram 등(8)은 X. campestris 세포 내의 catalase 존재를 확인하고 과산화수소의 xanthan 발효에의 적용을 제안하였다. 과산화수소 분해는 액상에서 직접 진행되어 산소가 기-액 접촉면을 통해서 액상에 전달되지 않고 생성되기 때문에 고점도 배양에서 중요한 의미를 갖는다. 특히, 과산화수소 분해는 고점도 xanthan 발효에서 커다란 공기 기포슬러그로 인한 좋은 혼합특성을 나타내는 기포탑 반응기에서 좋은 산소공급 보조수단이 될 수 있다.

본 연구에서는 고점도 xanthan 발효에서 탁월한 혼합 특성을 나타내는 기포탑에서의 산소전달속도를 향상시켜서 xanthan 생성속도를 증가시키고자 하였다. 우선, 과산화수소 분해를 이용한 산소공급방법을 사용하였고, 그리고 기포분쇄 효과를 나타내는 직경 8 mm 유리구슬을 유동화입자로 사용한 기-액-고 삼상유동층 반응기를 회분식 xanthan 발효에 적용하였다.

재료 및 방법

본 연구에서 사용한 기포탑 반응기는 내경이 0.15 m, 높이가 2.86 m이고 부피는 50 □이고(3), 삼상유동층 반응기는 내경 0.072 m, 높이 1.52 m, 부피 9 □이다. 삼상유동층 생물반응기에서 직경 8.0 mm의 유리구슬을 3.63 kg 사용하였으며, 유리구슬을 유동화 시키기 위하여 배양액을 유동층 상단 기-액 분리기에서 유동층 하단으로 연동펌프(604 S/R, Watson-Marlow)를 이용하여 외부순환 시켰다.

사용된 균주는 X. campestris NRRL B1459 S-4LII이다. 포도당을 탄소원으로, 염화암모늄을 질소원으로 이용한 합성배지를 사용하였으며, 그 조성(kg/m3)은 포도당, 50; 구연산 단수화물, 2.3; KH2PO4, 5; NH4Cl, 2; Na2CO3, 0.5; Na2SO4, 0.114; MgCl2·6H2O, 0.163; CaCl2·2H2O, 0.029; FeCl3·6H2O, 0.0024; ZnCl2, 0.0067; H3BO3, 0.006 이다(4). 포도당수용액은 다른 성분과 분리하여 멸균하였다. 발효온도는 28 ℃에서 유지하였고 배양액의 pH는 10% NaOH 수용액을 사용하여 pH 7 이하로 떨어지는 것을 방지하였다.

세포 건조중량은 시료의 점도를 낮추기 위해 1 wt % KCl 수용액으로 희석시킨 후 세포를 원심분리(30 min, 38000g, 4 ℃)한 다음, 물로 세척하여 다시 원심분리한 후, 40 ℃ 진공상태에서 48 시간 동안 건조시켜서 측정하였다. Xanthan의 건조중량은 배양액에서 원심분리로 세포를 제거한 상등액에 에탄올을 첨가하여 원심분리(30 min, 38000g, 20 ℃)로 xanthan을 침전시킨 다음, KCl 용액으로 용해하여 다시 원심분리한 후, 40 ℃ 진공상태에서 48 시간 동안 건조하여 측정하였다. 배양액의 포도당농도는 시료에서 세포를 제거한 후, 포도당분석기(Model 27, YSI) 또는 포도당 kit(영동제약)를 이용하여 측정하였다. 배양액의 유변학적 특성은 동축회전 원통점도계(Model 115, Contraves; RVT형, Brookfield)를 이용하여 측정하였다. 전단응력 □과 전단속도[eqn: rmdot gamma]의 관계는 Ostwald-de Waele 상관식으로 잘 묘사되었다:

[eqn: rmtau ~=~k cdot {{dot gamma}^n}]

(3)

여기서, k와 n은 각각 유체일관성인자와 흐름거동지수를 나타낸다.

결과 및 고찰

공기유속 0.10 m/s를 사용한 기포탑 발효에서 산소공급제한을 피하기 위하여 Figure 1에 나타낸 것과 같이 발효시작 48 시간이 지난 후에 30 % 과산화수소수(Perhydrol, Merck)를 용존산소농도가 포화농도의 10 % 아래로 떨어지기 시작할 때부터 주입하여 용존산소농도를 포화농도의 30±10 %에서 계속 유지하였다. 용존산소농도를 설정치에서 유지하기 위하여 과산화수소수의 주입유량을 계속 줄였다. 과산화수소수 주입은 균체 산소요구율을 감소시킨 것으로 추측된다. 그리고 과산화수소수 주입시 xanthan 농도를 나타내는 배양액 유체일관성인자는 거의 증가하지 않았다. 과산화수소수 주입은 xanthan 생성을 저해하였다. 발효시작 98.5 시간 후에 과산화수소수 주입을 중단하였으며 용존산소농도는 서서히 감소하면서 유체일관성인자는 다시 급격히 증가하였다. 과산화수소는 xanthan 생성을 가역적으로 저해하였다. 발효시작 130 시간 후 배양액의 포도당이 고갈된 다음 용존산소농도는 급격히 증가하였고 배양액 유체일관성인자는 22,870 mPa·sn(n=0.173)의 값을 나타내었으며 같은 유속을 사용한 기포탑 발효에서 과산화수소수를 주입하지 않았던 경우(k=29,970 mPa·sn, n=0.151)에 비해 낮은 점도수율을 나타내었다.

Sriram 등(8)은 교반식 반응기에서의 xanthan 발효에서 과산화수소수를 배양액에 펄스형태로 주입함으로서 과산화수소 분해에 의해서만 산소를 공급하여 용존산소농도를 포화농도의 50 % 이상으로 유지하였다. xanthan은 공기 포기를 이용하여 산소를 공급한 전형적인 발효에 비하여 1.75 배 높은 포도당에 대한 수율로 69 % 높은 8.3 g/L의 최종농도에 도달하였다. 그들은 과산화수소수만으로 산소를 공급한 반면에 본 연구에서는 공기로 포기하면서 산소전달제한 조건하에서의 부족한 산소전달을 보충하기 위하여 과산화수소수를 공급하였다. 본 연구에서 산소전달제한이 일어나는 비교적 높은 xanthan 농도를 나타내는 정상상태에서만 과산화수소수를 공급한 반면에 Sriram 등은 지수성장기부터 과산화수소수를 공급하였다. 일반적으로 낮은 xanthan 농도를 나타내는 균체 성장기에서는 전통적인 기-액 산소전달방법은 커다란 문제를 유발하지 않는 반면에, 높은 xanthan 농도를 나타내는 정상상태에서는 교반식 생물반응기의 정체구역을 유발하는 항복응력 등의 복잡한 유변학적 특성을 보이는 배양액의 혼합특성 문제가 더 중요한 의미를 가진다(2, 3).

Figure 2에 0.05 m/s의 공기유속을 사용한 삼상유동층 회분식 발효 결과를 나타내었다. 비교하기 위하여 같은 공기유속, 균주 및 배양조건을 사용한 기포탑 회분식 발효 중 xanthan 농도 변화도 함께 나타내었다. 배양액의 용존산소와 염화암모늄이 거의 동시에 약 30 시간의 발효시간이 경과한 후 고갈되었다. 지수성장기에서의 균 최대 비성장속도는 0.087 h-1의 값을, 최대균체량은 3.20 kg/m3의 값을 각각 나타내었다. 생성물인 xanthan 농도는 발효말기까지 계속 증가하여 84 시간이 경과한 후 25 kg/m3의 값을 나타내어 0.5 kg xanthan/kg glucose의 생성물 수율을 보였다. 발효 최종시료는 34,310 mPa·sn의 유체일관성인자와 0.127의 흐름거동지수를 각각 나타내었다. 반면에, 같은 공기유속을 사용한 기포탑 회분식 발효에서는 20 kg/m3의 xanthan 농도에 도달하는데 160 시간이 소요되었으며 0.4 kg xanthan/kg glucose의 생성물 수율을 나타내었으며 발효 최종시료는 22,420 mPa·sn의 유체일관성인자와 0.200의 흐름거동지수를 각각 나타내었다. 이러한 결과로부터 같은 공기유속을 사용할 경우 삼상유동층 발효가 기포탑 발효에 비해 높은 단위균체량 당 생성물 생성속도 및 기-액 산소전달속도를 나타내는 것으로 생각된다. 유동화 입자는 (a) 전단속도 증가에 의한 배양액 유효점도의 감소, (b) 반응기 단위액상부피 당 에너지 투입속도의 증가 및 (c) 기포분쇄 효과에 의한 반응기 단위부피 당 기-액 접촉면적을 증가를 유발시켜서 기-액 물질전달계수 및 산소전달속도를 증가시킨다(4).

삼상유동층의 유동화 입자는 기-액 산소전달속도는 증가시키나 발효에서 불활성이므로 반응기 내 배양액 부피를 약 20 % 감소시켜서 반응기 공간-시간 수율을 감소시킨다. 그러나 삼상유동층 발효는 0.273 kg xanthan/m3 culture broth·h의 xanthan 생성속도를 보여 같은 공기유속을 사용한 기포탑 발효(0.116 kg xanthan/m3 culture broth·h)에 비하여 배양액 부피 감소를 고려하고도 약 190 % 높은 반응기 공간-시간 수율을 보였다. 그리고 삼상유동층 발효의 최종시료가 기포탑 발효의 최종시료에 비하여 높은 유체일관성인자를 보이므로 삼상유동층 발효는 기포탑 발효에 비하여 높은 포도당 기질에 대한 점도수율을 나타내었다.

결론

기포탑 회분식 xanthan 발효에서 xanthan 생성속도와 분자량에 영향을 미치는 산소전달제한을 피하기 위하여 과산화수소수를 산소공급 보조수단으로 사용하였다. 과산화수소수 주입은 xanthan 생성을 가역적으로 저해하였다. 반면에 직경 8 mm 유리구슬 유동화 입자는 기-액 산소전달속도를 증가시켜서 기-액-고 삼상유동층 생물반응기에서의 xanrhan 발효는 기포탑 발효에 비하여 높은 단위균체량 당 xanthan 생성속도 및 점도수율, 그리고 반응기 공간-시간 수율(space-time yield)을 보였다.

감사

본 연구의 삼상유동층 발효는 한국과학재단 핵심전문연구과제(951-1104-020-2) 지원으로 수행되었으며, 이에 감사드립니다

참고문헌

1. Candia, J.-L. Flores and Deckwer, W.-D.: in M. C. Flickinger and S. W. Drew(Eds.), "Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation Vol. 5", Wiley, New York, 2695(1999).

2. Amanullah, A., Serrano-Carreon, L., Castro, B., Galindo, E., and Nienow, A. W.: Biotechnol. Bioeng., 57, 95(1998).

3. Suh, I.-S., Schumpe, A., and Deckwer, W.-D.: Biotechnol. Bioeng., 39, 85(1992).

4. Suh, I.-S. and Deckwer, W.-D.: HWAHAK KONGHAK, 34, 127(1996).

5. Peters, H.-U., Suh, I.-S., Schumpe, A., and Deckwer, W.-D.: Can. J. Chem. Eng., 70, 742(1992).

6. Suh, I.-S., Herbst, H., Schumpe, A., and Deckwer, W.-D.: Biotechnol. Lett., 12, 201(1990).

7. Schonbaum, G. R. and Chance, B.: in P. D. Boyer (Ed.), "The Enzymes Vol. 13", Academic Press, New York, 363(1976).

8. Sriram, G., Rao, Y. M., Suresh, A. K., and Sureshkumar, G. K.: Biotechnol. Bioeng., 59, 714(1998).

Fig. 1. Use of hydrogen peroxide for escaping the oxygen transfer limitation during the xanthan batch fermentation in a bubble column with the air velocity of 0.10 m/s.

Fig. 2. Batch xanthan fermentation in a three-phase fluidized bed with the air velocity of 0.05 m/s compared to the xanthan concentration course (▼) in the bubble column at the same air velocity.