삼상유동층 생물반응기에서의 연속식 Xanthan 발효

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

허충회, 서일순

건국대학교 화학공학과

Continuous Xanthan Fermentations in a Three-Phase Fluidized Bed Bioreactor

C. H. Heo, I.-S. Suh

Department of Chemical Engineering, Konkuk University

서론

Xanthan은 미생물이 세포 밖으로 배출하는 대표적인 세포외 다당류중 하나이다. 물에 잘 녹으며 적은 양으로 높은 점도를 얻을 수 있고 수용액은 강한 가소성을 나타낸다. 이러한 유변학적 성질은 온도, pH 및 염도 등의 변화에 거의 영향을 받지 않아 식품, 의약품, 화장품 및 화학산업에서 유화제, 안정제, 윤활제 및 응고제 등으로 널리 사용되고 있다(1). 산업적으로 xanthan은 절대 호기성 박테리아인 X. campestris에 의해 100 m3 이상의 대형 교반식 반응기에서 회분식으로 생산되고 있다. Xanthan 수용액의 독특한 유변학적 특성은 생물반응기의 기-액 산소전달, 혼합 및 열전달 등의 성능을 저하시킨다. 이러한 문제를 피하기 위하여 교반기와 반응기의 직경비가 비교적 큰 특수한 교반기를 채용하여 대량의 에너지를 투입한다.

회분식 xanthan 발효 중 세포 단위질량 당 xanthan 생성속도 qP[kg xanthan/kg CDM·h]는 Luedeking-Piret 상관식에 의해 균의 비증식속도 □에 부분적으로 연관된다:

[eqn: rmq_P ~~=~~A mu ~+~ B]

()

회분식 발효 초기의 세포 증식기 동안은 오른편 첫째 항으로 나타내지는 세포증식의 기여로 인해 발효후기의 정상기에 비해 높은 xanthan 비생성속도를 보인다. 연속식 발효에서의 xanthan 비생성속도는 세포 비증식속도 대신 반응기 희석률을 사용하여 식 (1)로 묘사될 수 있다. 균체 산소요구속도 [eqn: rmQ_O_2]도 부분적으로 균의 증식속도에 연관된다. 세포농도가 증가함에 따라 산소요구량이 증대되어 용존산소 농도는 감소하게 되고, 반응기 단위액상부피 당 기-액 산소전달속도 OTR은 증가하게 되며 용존산소농도는 어느 순간에 고갈된다. 용존산소가 고갈된 후에는 기-액 산소전달속도는, xanthan 농도 증가에 의한 배양액 점도 증가 때문에, 기-액 산소전달계수가 감소함에 따라 계속 감소하여 세포는 산소공급제한 조건하에 있게 된다. 따라서 비교적 높은 xanthan 농도를 보이는 정상기에서의 xanthan 비생성속도를 나타내는 식 (1)의 B는 기-액 산소전달속도가 정상상태에서의 산소요구률(0.078 kg O2/kg CDM·h)을 충족시키지 못하면 0.107 kg xanthan/kg CDM·h의 xanthan 비생성속도에서 급격히 떨어진 후 다음과 같이 산소전달속도에 대하여 선형적으로 감소하는 경향을 보인다(2):

[eqn: rm{B ~=~0.91 cdot (OTR/X~-~0.006)}]

(2)

반면에, xanthan 비생성속도의 세포 증식관련 항인 식 (1)의 A는, 회분식 발효에서 세포는 주로 xanthan 농도가 낮은 조건에서 증식되기 때문에, 산소공급제한 즉 산소전달속도에 영향을 받지 않아서 상수 값(0.97 kg xanthan/kg CDM)으로 일반적으로 표현된다(3).

배양액의 유변학적 특성에 커다란 영향을 미치는 xanthan 분자량도 세포의 증식속도와 기-액 산소전달속도에 영향을 받는다. 즉 세포 비증식속도가 증가함에 따라 분자량[eqn: rmM_W^*]이 큰 xanthan이 생성되며, 산소전달속도가 감소함에 따라 분자량이 작은 xanthan이 생성된다(3, 4):

[eqn: rmM_W sup * ~=~4.9·10 sup 6 ~+~ 3.8·10 sup 6 ``OTR/{Q_O_2} ~+~ 2.6·10 sup 7 mu]

(3)

Xanthan 발효 배양액은 강한 가소성 유변학적 특성을 나타낸다. 배양액 유효점도를 결정하는 유체일관성인자와 흐름거동지수는 xanthan 농도와 질량평균 분자량에 영향을 받는다(3). 세포 비증식속도와 기-액 산소전달속도에 영향을 받는 xanthan의 비생성속도와 분자량은 배양액의 유효점도에 커다란 영향을 미치어 역으로 다시 기-액 산소전달속도에 영향을 준다(2, 3).

기포탑은 높은 xanthan 농도의 고점도에서 형성되는 기포 슬러그 후류의 작용으로 인해서 좋은 혼합특성을 나타낸다(2). 이러한 기포 슬러그는 낮은 단위부피 당 기-액 접촉면적을 유발하여 기-액 산소전달속도를 감소시킨다. 반면에, 기포분쇄 효과를 보이는 직경이 큰 유동화 입자를 사용하는 기-액-고 삼상유동층 생물반응기는 xanthan 발효에서 높은 유효전단속도, 낮은 유효점도 및 높은 산소흡수효율을 나타낸다(5). 본 연구에서는 탁월한 혼합특성과 기-액 산소전달 특성을 나타내는 삼상유동층 생물반응기를 연속식 xanthan 발효에 적용하였다. 반응기 희석률 즉 균체 비증식속도의 변화가 xanthan의 비생성속도와 분자량에 미치는 영향을 관찰하였으며, 회분식 발효에서 얻은 결과(식 1)와 비교하였다.

재료 및 방법

본 연구에서는 직경 7.2 cm, 높이 152 cm, 부피 9 □의 스테인레스스틸 316 재질의 삼상유동층 생물반응기를 사용하였다(6). 반응기 내 기-액 산소전달을 촉진시키기 위하여 직경 8.0 mm의 유리구슬을 3.63 kg 사용하였으며, 유리구슬을 유동화 시키기 위하여 배양액을 유동층 상단 기-액 분리기에서 유동층 하단으로 연동펌프(604 S/R, Watson-Marlow)를 이용하여 외부순환 시켰다. 반응기 하단으로 공기필터를 거쳐 압축공기를 주입하여 필요한 산소를 공급하였다. 반응기 온도조절을 위하여 반응기 외벽에 재킷을 설치하였으며, pH controller (Monec 8935, Polymetron)를 사용하여 pH를 조절하였다.

균주 X. campestris NRRL B1459 S-4LII를 사용하였다. 균주의 보존배양에는 YMG 한천을 이용한 고형배지를 사용하였다(5). 같은 조성의 YMG 액체배지를 일차종균배양에 사용하였고, 이차종균배양에는 생물반응기 생산발효에 사용한 포도당을 탄소원으로, 염화암모늄을 질소원으로 이용한 합성배지를 사용하였다(6). 포도당용액은 다른 성분과 분리하여 멸균하였다.

일차종균배양은 보존배양으로 식균하여 28 ℃에서 24 시간 동안 진탕 배양하였다. 이차종균배양은 멸균한 합성배지에 일차종균배양을 접종한 후 28 ℃에서 48 시간 동안 진탕 배양하였다. 종균배양 및 생산발효의 접종량은 10 %(v/v)를 유지하였다. 생물반응기는 1 기압(계기압력) 121 ℃의 수증기로 30 분 동안 멸균한 다음 autoclave에서 멸균한 생산발효배지를 주입하고 삼각플라스크에서의 이차종균배양액을 식균하였다. 접종 후 발효기 내에 압축공기를 주입하면서 발생하는 거품은 소포제를 사용하여 제거하였다. 발효온도는 28 ℃에서 유지하였고, 배양액의 pH는 10 % NaOH 수용액을 주입하여 pH 7 이하로 떨어지는 것을 방지하였다. 발효초기에는 균의 증식을 위하여 반응기를 회분식으로 운전하였으며, 최대 비증식속도를 나타내는 지수성장기 중 연속식 배양으로 전환하였다. 회분식 발효에서 사용한 영양배지와 동일한 조성의 배지를 연속발효에서도 사용하였다.

시료의 세포 건조중량 및 xanthan 농도는 원심분리 및 건조하여 측정하였다(6). Xanthan의 건조중량은 시료에서 원심분리로 세포를 제거한 후, 에탄올을 첨가하여 원심분리(60 min, 20000g, 20 ℃)로 xanthan을 침전시킨 다음, KCl 용액으로 용해하여 재침전 원심분리한 후, 80 ℃에서 48 시간 동안 건조하여 측정하였다. 시료에서 세포를 제거한 후, 포도당농도와 염화암모늄 농도를 포도당 측정 kit(영동제약)와 분광기(DR-2000, Hach)를 각각 이용하여 측정하였다. 배양액의 유변학적 특성은 동축회전 원통점도계(RVT형, Brookfield)를 이용하여 측정하였다.

결과 및 고찰

삼상유동층 생물반응기에서 0.05 m/s 공기유속을 사용한 연속식 발효 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 발효 초기에는 30 kg/m3의 포도당 농도 및 1.0 kg/m3의 염화암모늄 농도를 사용하여 회분식으로 발효를 진행시키다가 지수성장기 말기에 연속식으로 전환하였다. 연속식 발효에서 낮은 유입수 염화암모늄 농도(1.0 kg/m3)를 사용하여 산소공급제한을 피할 수 있었다. 유입수 유량을 1.81 L/d에서 8.96 L/d까지 증가시킴에 따라, 용존산소 농도는 포화농도의 10 %에서 40 %까지 증가하였고, 균체농도는 2.39 kg/m3에서 1.86 kg/m3으로 약간 감소하였으며, 포도당 농도는 8.96 kg/m3에서 20.3 kg/m3으로 증가한 반면에 xanthan 농도는 16.8 kg/m3에서 7.36 kg/m3로 감소하였다(Table 1).  유입수 유량(반응기 희석률)이 증가함에 따라, 세포 비성장속도 증가로 인한 산소요구률의 증가보다 xanthan 농도 감소로 인한 반응기 유효점도 감소가 유발하는 반응기 최대 산소전달속도(기-액 산소전달계수)의 증가 효과가 커서 용존산소 농도가 증가한 것으로 생각된다. 반응기 희석률(유입수 유량)이 0.0136 h-1에서 0.0675 h-1까지 증가함에 따라 생성된 xanthan의 평균분자량이 7.62·106 g/mol에서 9.12·106 g/mol까지 증가하였고, 균체 비성장속도가 증가함에 따라 xanthan의 분자량이 증가한다는 식 (3)의 예측결과와 정성적으로 일치하였다. 반면에, 2 kg/m3의 유입수 염화암모늄 농도를 사용한 경우(CXF1, 2), 균체농도는 약 배로 증가하였고 산소전달제한이 발생하였다. 염화암모늄이 균의 성장을 제한하는 영양소이었다.

연속식 발효에서 반응기 희석률 변화에 따른 세포 단위건조질량 당 xanthan 생성속도의 변화를 Fig. 2에 나타내었다. 산소전달이 충분한 경우 희석률이 증가함에 따라 xanthan 비생성속도는 증가하였다. 그러나 0.0351 h-1 이상의 희석률에서는 회분식 발효 결과(식 1) 보다 상당히 높은 xanthan 비생성속도를 보였다. Peters 등(3)은 본 연구에서와 같은 균주 및 영양배지를 사용한 교반반응기 chemostat에서의 xanthan 발효에서 비슷한 결과를 관찰하였으며 연속발효에서의 xanthan 비생성속도에 대해 다음 식을 제안하였다:

[eqn: rmq_P ~=~0.117+3.93 mu -25.3 mu^2]

(4)

본 연구의 결과는 식 (4)에 의해 잘 묘사되었다. 연속발효 중 균이 구연산을 계속 소모한 것이 발효초기에 구연산이 고갈되는 회분식 발효와 비교할 때 높은 xanthan 비생성속도를 유발한 것으로 사료된다(3, 7). 구연산은 원래 영양배지 멸균과정에서 다른 영양분의 침전을 막기 위하여 영양배지에 첨가되며 회분식 발효에서 발효 시작 하루 안에 모두 소모된다. 회분식 발효에서 균이 구연산을 아직 소모할 수 있는 낮은 xanthan 농도의 발효 초기에 본 연구에서 관찰된 높은 xanthan 비생성속도와 비슷한 약 0.25 kg xanthan/kg CDM·h의 비생성속도를 관찰할 수 있었다(5).

반면에, 2 kg/m3의 유입수 염화암모늄 농도를 사용한 산소공급제한이 발생한 경우 상당히 낮은 xanthan 비생성속도가 나타났다. 식 (2)에 의하면 산소공급제한이 발생할 경우 비성장관련 xanthan 생성속도는 0.107 kg xanthan/kg CDM·h에서 0.0655 kg xanthan/kg CDM·h로 급격히 감소한 후 산소전달속도가 감소함에 따라 감소한다. 이러한 비성장관련 xanthan 생성속도의 감소는 Fig. 2의 xanthan 비생성속도의 감소(희석률 0.043 h-1에서 0.1567 kg xanthan/kg CDM·h의 비생성속도 감소)를 설명하기에는 불충분하다. 산소공급제한이 성장관련 xanthan 비생성속도(식 1의 A)에도 영향을 미치는 것으로 생각된다. 회분식 발효에서 산소공급제한은 낮은 xanthan 농도를 나타내는 세포 증식기 동안에는 발생하지 않는다. 따라서 회분식 발효결과에서 얻은 식 (1)을 연속식 발효에서 산소공급제한이 일어나는 경우에 적용하는데는 문제가 있다. 산소공급제한 연속발효에서의 낮은 단위균체량 당 xanthan 생성속도 때문에 높은 균체농도에도 불구하고 반응기 단위액상부피 당 xanthan 생성속도는 산소공급제한이 발생하지 않은 경우에 비하여 낮은 값을 보였다(Table 1). 산소공급제한이 발생한 경우 실제 기-액 산소전달속도는 높은 산소전달구동력과 낮은 xanthan 농도로 인한 높은 기-액 산소전달계수 때문에 산소공급제한이 발생하지 않은 경우에 비하여 높은 값을 보인다. 낮은 반응기 단위액상부피 당 xanthan 생성속도와 높은 기-액 산소전달속도로 비추어 볼 때 산소공급제한이 일어난 경우 xanthan의 산소에 대한 겉보기수율은 산소공급제한이 발생하지 않은 경우 보다 낮은 값을 보인 것으로 생각된다.

결론

반응기 희석률을 증가시킴에 따라 세포 단위질량 당 xanthan 생성속도 및 생성된 xanthan의 분자량은 증가하였다. 산소공급제한이 발생하지 않을 경우 연속발효에서의 xanthan 비생성속도는 회분식 발효결과 보다 상당히 높은 값을 보였다.

참고문헌

1. Candia, J.-L. Flores and Deckwer, W.-D.: in M. C. Flickinger and S. W. Drew(Eds.), "Encyclopedia of Bioprocess Technology Vol. 5", Wiley, New York, 2695(1999).

2. Suh, I.-S., Schumpe, A., and Deckwer, W.-D.: Biotechnol. Bioeng. 39, 85(1992).

3. Peters, H.-U., Suh, I.-S., Schumpe, A., and Deckwer, W.-D.: Can. J. Chem. Eng. 70, 742(1992).

4. Suh, I.-S., Herbst, H., Schumpe, A., and Deckwer, W.-D.: Biotechnol. Lett. 12, 201(1990).

5. Suh, I.-S. and Deckwer, W.-D.: HWAHAK KONGHAK 34, 127(1996).

6. Suh, I.-S., Roh, H. C., and Heo, C. H.: Korean J. Biotechnol. Bioeng., 17(in press).

7. Souw, P.: in M. Moo-Young, C. Vezina, and K. Singh(Eds.), "Advances in Biotechnology Vol. 3", Pergamon Press, Toronto, 447(1981).

Table 1. Summary of the continuous xanthan fermentations in a TPFB bioreactor with glass beads of 8 mm diameter at the air velocity of 0.05 m/s.

Fermentation	CXF1(a)	CXF2(a)	CXF41	CXF31	CXF42	CXF32
Flow rate [L/d]	3.07	5.77	1.81	4.66	6.24	8.96
Cell [kg/m3]	4.01	3.87	2.39	2.08	2.01	1.86
Substrate [kg/m3]	7.20	12.2	8.96	13.9	16.6	20.3
Xanthan [kg/m3]	11.9	7.34	16.8	12.6	10.7	7.36
Fluid consistency factor [Pa·sn]	n.a.	n.a.	13.21	9.322	4.933	2.308
Flow behavior index n [-]	n.a.	n.a.	0.227	0.220	0.278	0.300
Productivity [kg xanthan/m3·h]	0.275	0.319	0.277	0.444	0.503	0.498
Molecular weight·10-6 [g/mol](b)	n.a.	n.a.	7.62	8.60	8.12	9.12

(a) under the oxygen limitation with the influent NH4Cl concentration of 2 kg/m3.

(b) calculated from xanthan concentration, fluid consistency factor, and flow behavior index.

Fig. 1.	Time-courses of continuous xanthan fermentations in a three-phase fluidized bed bioreactor at the influent NH4Cl concentration of 1.0 kg/m3 and the gas velocity of 0.05 m/s.

Fig. 2. Xanthan productivity as a function of dilution rate in the continuous fermentations in a TPFB bioreactor at the air velocity of 0.05 m/s; ●, without the oxygen transfer limitation at the influent NH4Cl concentration of 1 kg/m3; ○, under the oxygen transfer limitation at the influent NH4Cl concentration of 2 kg/m3; □, from the batch fermentation without the oxygen transfer limitation (2); ―, predicted by eqn 4 (3); …, calculated by eqn 1 (3).