Chlamydomonas reinhardtii를 이용한 생물학적 수소 및 유기물 생산

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

공경택*,***, 심상준**, 박태현***

한국과학기술연구원 수질환경 및 복원연구센터*,

성균관대학교 화학공학과**, 서울대학교 응용화학부***

Biological hydrogen and organic acid production

using Chlamydomonas reinhardtii

K. T. Kong*,***, S. J. Sim**, T. H. Park***

Water Environment & Remediation Research Center,

Korea Institute of Science and Technology*,

Department of Chemical Engineering, Sungkyunkwan University**

화학공학의 이론과 응용 제 8권 제1호 2002년

화학공학의 이론과 응용 제 8권 제1호 2002년

School of Chemical Engineering, Seoul National University***

서론

현재 수소가 차세대 에너지원으로 각광받고 있는 것은 수소가 가지는 에너지로써의 강력한 이점 때문이다. 대체 연료로써 수소가 갖고 있는 장점은 깨끗하며, 효율적이고, 재생이 가능하며, 부산물로 이산화탄소나 NOx, SOx와 같은 유해기체를 생산하지 않는다는 것이다. 이로 인해 수소는 석탄, 석유와 같은 화석연료를 대체할 환경친화적 에너지 자원으로써 국제적인 연구가 활발하게 진행되어지고 있다[1].

수소를 생산하는 여러 가지 방법 중에서 생물학적으로 수소를 발생하는 방법이 꾸준하게 연구되고 있다. 자연에서는 오직 bacteria와 algae와 같은 미세조류만이 수소를 생산하는 능력이 있다. 이러한 미세조류 중에 연구되고 있는 분야는 anaerobic bacteria, photosynthetic bacteria, cyanobacteria, green algae에 관한 것이다. 이중 green algae와 cyanobacteria는 물을 분해하여 수소와 산소를 생산하기 때문에 많은 연구가 진행 중이다[2]. 생물학적 수소생산은 혐기적 조건하에서만 활성을 가지는 효소인 nitrogenase나 hydrogenase에 의해 이루어진다. hydrogenase가 O2에 의해 저해를 받기 때문에, 광합성에 의한 O2와 H2의 생산을 시간적 혹은 공간적으로 분리시키는 two-stage 공정으로 이루어져야만 한다. 이러한 two-stage 공정에서 먼저 CO2는 일반적인 광합성을 통해 H2 생산을 위한 내인성 기질(endogenous substrate)로 고정화되고(stage 1), 그 다음 녹조류가 혐기적 조건하에서 배양될 때 수소를 생산하는 공정(state 2)으로 구성된다[3].

Chlamydomonas reinhardtii는 green algae로써 대기 중에 있는 CO2를 기질로 하여 광합성을 통해 성장하며, 혐기적 조건하에서 수소와 유기물질을 생산한다[4]. 본 연구에서는 이러한 Chlamydomonas reinhardtii를 이용하여 실험을 수행하였다. 실험은 Chlamydomonas reinhardtii의 성장과 여러 조건하에서의 수소와 유기물의 생산량을 조사하고자 하였다. 또한 혐기발효를 통한 수소생산 뿐만 아니라 여기서 발생되는 발효산물인 유기물은 수소 생산성이 비교적 높은 광합성 박테리아의 기질로 공급이 가능하기 때문에, 본 연구에서는 명주기에서는 균주의 성장을, 암주기에서는 혐기발효를 통해서 수소와 유기산이 생산되는 것을 기본으로 하였다.

실험

실험에 사용한 균주는 green algae의 일종인 Chlamydomonas reinhardtii UTEX 89, Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90, Chlamydomonas reinhardtii UTEX 2246이고, 배지는 bristol's solution을 사용하였다. 계대배양은 250 ml erlenmeyer flask에서 2주일에 한 번씩 실시하였고, 접종량은 10% (v/v)로 하였다. 본 실험에서는 400 ml 용량의 bubble column을 사용하였다. 이때 사용한 bubble column의 지름은 3.5 cm이었고, 빛은 양쪽 측면에서 공급하였다. 빛은 형광등으로 100 □E/m2□s로 공급하였고, 온도는 25 ℃로 고정하였다. 혼합가스는 CO2와 공기를 혼합하여 100 ml/min으로 공급하였다. 혼합가스에서 CO2의 비율에 따라 균체의 성장을 살펴보았고, 성장한 균체는 120 ml 용량의 serum bottle에 1.0 mg/ml 농도로 80 ml 넣어 dark fermentation을 수행하였다. Dark fermentation을 하기 직전에 수소를 생산하는 조건인 혐기조건을 만들어주기 위해 N2로 20분간 purging하여 기상 및 액상에 존재하는 산소를 제거하였다. 빛이 통과하지 않는 조건하에서 일정시간 동안 혐기발효(Dark fermentation) 시킨 균체를 이용하여 수소와 기타 유기산의 생산량을 비교하였다. 수소 분석은 GC (TCD)를 이용하였고, 에탄올, 아세트산, 글리세롤의 분석은 GC (FID)를 이용하였다. 균체의 농도는 660nm에서 흡광도를 측정하여 건조중량을 추정하였다. (Dry Cell Weight (g/L) = 0.305 × OD660). 수소는 syringe를 이용하여 serum bottle의 headspace에 있는 기체(H2 & N2)를 분석하여 headspace에 있는 수소의 비율을 측정하였다. 유기산의 측정은 혐기발효 시킨 후의 균체를 원심분리한 후 여과를 거쳐 상등액을 GC에 주입하였다. 이 때, 정확한 피크를 보기 위하여 50% H2SO4를 이용한 acidification의 과정을 이용하였다.

결과

실험에 사용한 Chlamydomonas reinhardtii UTEX 89, Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90, Chlamydomonas reinhardtii UTEX 2246의 세 가지 중에서 12시간 dark fermentation을 거친 결과 수소를 생산하는 균주는 Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90뿐이었다. 암주기를 거친 후의 유기산 생성의 결과를 살펴보면 수소가 생성된 Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90과 나머지 두 균주의 유기산 생성 패턴이 다름을 알 수 있었다. 에탄올이나 아세트산은 Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90이 다른 균주에 비해서 생성량이 많았고, 글리세롤의 경우에는 반대로 Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90이 2 배 정도 낮은 생산성을 나타내었다. 실제로 유기산 중에서 글리세롤의 경우 광합성 박테리아를 이용한 수소생산 시 이용가치가 떨어지므로 수소나 유기산의 생성으로 볼 때 Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90이  가장 적절하다고 판단하였다. 따라서 이후의 실험은 수소 생산성이 있고 유기산의 이용 가능성이 높은 Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90으로 수행하였다.

Chlamydomonas reinhardtii는 탄소원으로 CO2를 이용하기 때문에, 먼저 광합성을 통해서 균체가 성장하는데 적절한 CO2 비율을 알아보기 위하여 1%, 3%, 5%에 따른 균체의 성장을 관찰하였다. Fig.1에서와 같이 1% CO2 와 3% CO2 에서는 CO2 비율에 관계없이 성장이 비슷하였고, 균체의 성장도 정상적으로 관찰되었다. 그 결과 완전히 성장했을때 균주의 밀도는 약 1 g/L 이었다. 하지만 5% CO2 에서는 성장에 현저한 저해를 보였다. 이로써 Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90은 비교적 낮은 5% CO2에서 기질로 인한 저해를 받는 것을 알 수 있었다.

성장한 균주를 이용한 dark fermentation은 CO2 비율, dark fermentation time, dry cell weight(DCW)에 변화를 주어 실험을 수행하였다. Dark fermentation을 수행하면서 균주는 성장을 멈추게 되고 광합성으로 얻어진 산물을 이용하여 수소와 유기산을 생성하게 된다. Dark fermentation time을 60시간 이상 수행했을 경우에 현미경으로 살펴본 결과 균주는 운동성이 없었고, cell lysis가 일어난 상태였다. 또한 균체의 색도 정상적인 녹색을 띄지 않았다. Table 1 에서의 결과를 살펴보면, 15시간 dark fermentation했을 경우에 아세트산은 DCW가 0.75 g/L일 경우보다 0.90 g/L일 경우가 4 - 5 배 정도 더 많은 양이 검출되었다. 하지만 글리세롤이나 에탄올의 경우는 거의 비슷하거나 약간 감소한 경향을 보였다. 그리고 1% CO2에서 키운 균주는 생성된 유기산 중 글리세롤의 생성비가 2 배 이상 높았다. 또 dark fermentation time을 변화시켰을 경우에는 기준치보다 4배 이상 더 오래 fermentation 했을 경우에도 유기산의 생성량은 크게 다르지 않다는 것을 알 수 있었다(Table 2). 이와 같은 결과로 유기산 생성에는 dark fermentation time보다 균체의 성장주기가 더 중요한 요소임을 알 수 있었다. Dark fermentation 수행 시 생성된 수소는 Table 3 에 정리하였다. Table 3에서 보는 바와 같이 수소 생산성은 시간에 비례하는 것이 아니라 어떠한 maximum point가 존재함을 알 수 있었다. 또한 수소의 생산량은 3% CO2에서 배양했을 경우보다 1% CO2에서 배양했을 경우가 더 높은 생산량을 나타내었다. 또한, dark fermentation time이 15시간일 경우와 48시간일 경우를 비교해 보면, 수소는 점차적으로 발생하는 것이 아니라 균주의 성장곡선과 같이 지연기를 거친 후에 급격히 생산되고 있음이 관찰되었다.

본 연구에서는 Chlamydomonas reinhardtii를 이용하여 다양한 조건하에서 수소와 유기물의 생산성을 비교해 보고자 하였다. 다른 CO2 비율에서 유사하게 성장한 균체가 실제로 혐기발효 후에 유기물이나 수소의 생산량에 큰 차이를 보이고 있음을 알 수 있었으며, 유기물 생산의 경우는 균체의 상태가 중요한 영향을 미치고 있음을 알 수 있었다.

참고문헌

1. A. Hansel and P. Lindbald: Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 153-160(1998)

2. K. Krisna Rao and David O. Hall: J. Mar. Biotechnol., 4, 10-15(1996)

3. Maria L. Ghirardi et al.: Tibtech December, 18, 506-510(2000)

4. Elizabeth H. Harris: "The Chlamydomonas Sourcebook : A comprehensive Guide to biology and Laboratory Use", Academic Press, Inc.(1989)

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

Fig.1 The CO2 effects on growth of C. reinhardtii UTEX 90

Table 1. Organic acid production at different DCW

CO2 %	DCW (g/L)	Organic acid (mg/L)
		Acetic acid	Glycerol	Ethanol
1	0.75	68	414	149
	0.90	255	409	135
3	0.75	77	279	209
	0.90	366	261	153

Table 2. Organic acid production at different fermentation time

CO2 %	Dark fermentation time(h)	Organic acid (mg/L)
		Acetic acid	Glycerol	Ethanol
1	15	255	409	135
	62	284	324	118
3	15	336	261	153
	62	345	475	137

Table 3. Hydrogen production rate* at different fermentation time

fermentation time(h) CO2 %	15	48	62
1	0.20	7.80	5.24
3	0.36	5.29	4.14

(*:□mol/mg DCW)