Drowning-out을 통한 L-proline 결정화를 위한 Co-solvent 선정

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

최재원', 김예훈□, 함승주', 정준기"

연세대학교 화학공학과□

생명공학연구소□

The Selection of Co-solvent for Drowning-out Crystallization of L-proline

Jae Won Choi', Ye Hoon Kim', Seungjoo Haam', Joon-Ki Jung"

Dept. of  Chemical Engineering, Yonsei University'

Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology"

서론

Proline은 L형, D형, DL형으로 구분되며 이 중 L형은 proline의 천연형태의 아미노산으로 써 제약제품의 원료로 사용되고 있고 생리활성 및 고기능성 질병예방용, 항암, 항당뇨 기능성과 같은 신약개발에서 중요한 요소로 두각되고 있다[1]. 일반적으로 아미노산계의 결정화는 냉각법, 용매 추출법 그리고 증발법등의 방법들이 쓰이며 현재 L-proline의 결정화는 증발법에 의존하고 있다[2]. 하지만 증발결정법을 통한 L-proline의 결정화는 비용 상승, 증발기 등의 부대시설 문제와 변색, 결정 크기와 형성인자의 조절의 어려움 등의 단점을 가지고 있다. 이런 점을 보완하기 위해서 생산 및 분리공정을 연속적으로 한 공정에서 수행할 수 있는 L-proline의 결정화 연구가 필요하다[2,3]. 이를 위해 drowning-out 결정화의 핵심인 co-solvent선정 및 이를 통한 결정화 연구를 수행하였다[4,5,6,9].

실험

1. 물질

본 연구에서는 사용한 시료들은 L-proline은 ACROS ORGANICS 사에서 구입하였고  co-solvent로는 3 종의 4 용매를 선정하였다[6,7,8]. 이들 용매는  pyrroline계열의 1개, furan계열의 2개 그리고 cyclopentanone이다. furan 계열로는 Tetrahydrofuran(THF), Furfuryl alcohol을 선정하였다. 모든 시약은 ACS grade로 Sigma-Aldirich사에서 구입하였고 실험에서 사용한 물은 Four-Holder Water Purification System (Cole-Parmer)으로 정제하여 사용하였다.

2. 실험

상온에서 100% L-proline용액 3g을 100□ cell에 넣은 후 각각의 co-solvent을 1.72g/min의 속도로 투입하여 co-solvent의 결정화 영향을 실험하였다. 그리고 co-solvent의 결정화 영향 실험을 통한 선정된 co-solvent를 사용하여 L-proline 결정화를 하였다. 온도 변화에 의한 영향을 배제하기 위하여 circulator 통해 25℃로 유지된 100□용량의 double jacket reactor에 30% L-proline 수용액 2g을 투입한 후 peristaltic pump(EYELA, MP-3N)를 사용하여 투입속도는 1.17∼8.7g/min 의 범위에서 실험하였고 교반속도는 magnetic stirrer를 사용하여 RPM 50∼100까지 변화시켜 실험하였다. 생성한 결정은 여과하여 dry oven으로 65℃에서 12시간 가량 건조한 뒤 광학현미경으로 확인하였다.

결론

1. Co-solvent 선정

Co-solvent 선정은 drowning-out crystallization에서 결정화를 판가름하는 가장 중요한 변수이다. 비용 절감과 연속성의 이점을 가졌지만 아직 일반화되지 않은 drowning-out crystallization의 문제 역시 co-solvent 선정의 어려움으로 인한 것이다. 특히 L-proline은 아민기와 카르복실기를 각 1개씩 포함하여 중성의 등전점을 갖고 있으며(그림 1), 물에 대하여 다른 아미노산에 비해 매우 우수한 용해도를 가지고, 일반적으로 co-solvent로 자주 쓰이는 1∼2개의 탄소를 가지는 저급알코올류(MeOH, EtOH)에서 녹지않는 특성을 가지므로 co-solvent 선정의 더욱 어렵다. 따라서 본 연구에서는 L-proline의 co-solvent 선정에 분자구조유사성과 수소결합을 적용하여 co-solvent를 선정하였다(그림 2). pyridine을 가지는 L-proline과 유사한 구조를 가진 furan 계열의 용매, cyclopentanone 그리고 pyridine 계열의 용매의 결정화 효과를 연구한 결과, 분자내에 산소원자의 영향이 큰 furan계열의 용매들과 cyclopentanone의 결정화 영향이 아민기를 함유한 pyrrolidine계열의 용매보다 상당히 낮아 THF와 cyclopentanone에서는 층분리 현상이 발생되었고, frufuryl alcohol에서는 L-proline 결정이 생성 후 다시 용해되었다. L-proline 결정화 영향이 높은 pyrrolidine 계열에서도 수소결합의 영향으로 인하여 결정화에 각기 다른 영향을 보였다. 이러한 결과 분자구조유사성과 물과 수소결합력이 우수한 NMP가  L-proline의 결정화에 가장 적합한 co-solvent임을 알 수 있었다.

2. Drowning-out crystallization

위의 실험결과로 co-solvnet로 선정한 NMP를 통한 L-proline의 drowning-out crystallization을 연구를 위한 용해도 실험 결과, 그림 3에서 보이는 바와 같이 NMP농도 변화에 따라 L-proline의 녹는 양의 지수적 변화을 확인하여 결정화 가능성을 확인하였다. 그리고 결정화 실험에 따르는 변수로 co-solvent의 투입속도 및 교반속도가 온도 등의 다른 변수보다 결정화 공정의 가장 중요한 변수임이 연구를 통해 밝혀졌다. 우선 Feeding rate 1.17g/min에서 RPM 100, 60, 50으로 실험 결과, 결정의 수율은 각각 0.39, 0.43, 0.42g이로 큰 차이는 없었으나 결정 크기에 큰 변화가 있었다. RPM 변화에 따른 결정의 변화는 그림 4에 도시하였다. 100 RPM에서는 결정크기가 2∼5□로 매우 작았고(그림 4의 a) 60 RPM에서는 결정이 25∼50□정도까지 성장하였다그림 4의 b). 50 RPM에서는 60RPM와 유사하게 성장한 결정을 볼 수 있으나 핵이 많이 발생하여 60 RPM보다 못한 효과를 보였다(그림 4의 c). 따라서 최적 RPM은 60임을 알 수 있었다. 두 번째, 위의 실험 결과에서 밝혀진 최적 60 RPM을 기준으로 하여 최적 feeding rate을 알아보기 위해 feeding rate 1.17g/min∼8.7g/min 범위에서 실험하였다. 그림 5에 광학현미경으로 본 결정을 나타내었다. 1.17g/min일 때(그림 5의 a) 25∼50□의 결정이 적은 반면 feeding rate이 증가할수록 결정의 크기가 커져 7.3g/min에서 30□의 일정한 결정의 분포를 나타내며(그림 5의 c)그 이상인 8.7g/min에선 오히려 10∼60□으로 결정의 분포가 나쁘며 얇게 성장하였다(그림 5의 d)(수율=0.45∼0.5g). 그 결과 L-proline 결정 크기에 적합한 공정변수는 60 RPM에  7.3g/min의 feeding rate이다. 30% L-proline 수용액 2g에 포함된 L-proline의 양은 0.6g이므로 NMP를 통한 결정화 공정에서의 수율은 매우 높음을 알 수 있었다. 결정화한 L-proline을 ACROS ORGANICS사의 L-proline과 FT-IR을 통하여 비교하여(그림7,8) 동일한 L-proline임을 확인하였고 그림 6에 SEM으로 확인한 L-proline 결정을 보였다.

1-Methy-2-pyrrolidinone     Tetrahydrofuran

(NMP)               (THF)

furfuryl alcohol       cyclopentanone

그림 1 L-proline의 분자 구조식             그림 2 Co-solvent의 분자 구조

그림 3 NMP 용해도 (25℃)

(a) 100 RPM

(b) 60 RPM

(c) 50 RPM

그림 4 교반속도 변화에 따른 L-proline 결정의 변화

(a) 1.17 g/min

(b) 2.21 g/min

(c) 7.3 g/min

(d) 8.7 g/min

그림 5 투입속도 변화에 따른 L-proline 결정의 변화

그림 6 NMP로 결정화된 L-proline

그림 7 NMP로 결정화된 L-proline의 FT-IR

그림 8 ACROS ORGANICS의 L-proline의  FT-IR

참고문헌

1. Jesse P. Greenstein and Milton Winitz,: "Chemistry of the Amino Acids", Vol 3,             2178-2201,(1961)

2. J.W. Mullin,: "Crystallization", Third Edition,

3. Narayan S. Tavare,: "INDUSTRIL CRYSTALLIZATION Process Simulation Analysis and      Design"

4. ISSBUCH, L. ADDADI, M. LAHAV, L. LEISEROWITZ, Molecular Recognition at Crystal

Interfaces, Science, Vol 253, 637-645, (1991)

5. Allan S. Myerson, Handbook of Industrial Crystalliazation, Butterworth-Heinemann, 1992

6. Meir Lahav, Leslin Leiserowitz,: "The effect of solvent in crystal growth and morphology",

Chmical Engineering Science, 56, 2245-2253, (2001)

7. Yasuyoshi Ueda, Hajime Manabe, Mitsutaka Kitamura, and Hirokatsu Masuoka,: "Molecular     ricognition and crystallization behavior of Lisinopril ester", Crystal Engneering, 4, 329-341,     (2001)

8. H. Oosterhof, G.J. Witkamp, G.M. van Rosmalen,:"Some antisolvents for crystallisation of      sodium carbonate", Fluid Phase Equilbria,155, 219-227, (1999)

9. C.M. Pina, L. Fernandez-Diaz, M.Prieto, S. Veintemillas-Verdaguer,: "Metastability in          drowning-outcrystallisaton:precipitation of highly soluble sulphates", Journal of Crystal         Growth, 222, 317-327,(2001)