천연 고분자를 이용한 비바이러스성 유전자 전달체 합성

최혜영, 나재운．

순천대학교 공과대학 고분자공학과

jwnah@sunchon.ac.kr

The Synthesis of Non-Viral Gene Carrier using a Natural Polymer

Hey Young Choi, Jae-Woon Nah．

Dept. of Polymer Science and Enginnering, Sunchon National University

jwnah@sunchon.ac.kr

서론

유전자 치료는 다양한 선천적 후천적 질병을 치료하기 위한 새로운 접근으로서 부각되고 있다.  유전자 치료법은 치료 단백질의 생성을 유도할 수 있는 유전자 물질을 환자의 세포 속에 도입함으로써 질병을 치료할 수 있는 방법이다. 지금까지는 유전자 치료를 위한 대부분의 연구가 뛰어난 전이 효율성의 장점을 지니고 있는 바이러스성 유전자 전달체에 집중되어 왔지만[1], 여러 가지 치명적인 문제점으로 인하여 안전하고 효율적인 유전자 치료법으로서의 비바이러스성 유전자 전달체에 관한 비중이 높아져가고 있는 실정이다[2]. 비바이러스성 유전자 전달체 중, 양이온성 지질이나 Poly-L-Lysine (PLL), Polyethylenimine (PEI)과 같은 합성 고분자는 in vitro계에서는 효율적인 DNA 전달체이지만, 낮은 생체적합성으로 인하여 in vivo계에서의 응용성은 크게 뒤떨어지고 있다[3]. 한편, 천연 고분자인 키토산은 생체 분해성 다당류이고 무독성이며 강한 양전하를 띠고 있어 DNA와 쉽게 결합할 수 있어 새로운 유전자 전달체로서의 우수한 가능성을 띠고 있다. 최근 저분자량 수용성 키토산 (Low Molecular, Water-Soluble Chitosan ; LMWSC)을 이용하여 유전자 전달체로서의 가능성을 조사한 결과 LMWSC은 무독성이며 PLL보다 높은 전이 효율을 나타냈다라는 특성을 밝힌 바 있다[4].

인간의 세포 내에서는 끊임없이 막이 파괴되고 더불어 많은 양의 막이 합성된다. 이때 반드시 콜레스테롤이 필요하다. 대부분의 콜레스테롤의 운반은 콜레스테롤이 단백질에 결합된 저밀도 지단백 (Low density lipoprotein ; LDL)의 형태로 이루어진다. LDL은 수용체가 매개된 세포내 유입 과정을 통해서 다른 형태의 세포에 의해 유입될 수 있다. LDL의 주요 단백질 성분인 Apolipoprotein B-100 (apo B-100)은 LDL 수용체 결합 영역, 동맥 벽 세포 결합 영역 그리고 헤파린 결합 영역과 같은 많은 수용체 결합 영역을 포함한다. Shih 등은 apo B-100의 1000-1016 아미노산 잔유기를 포함하는 합성 펩타이드는 apo B-100의 동맥 벽 결합 영역임을 설명하였다[5].

본 연구에서는 LMWSC을 이용하여 동맥경화와 심장 동맥 재협착과 같은 동맥에 관련된 질병을 치료하기 위한 동맥 벽 세포 표적성 유전자 전달체를 합성하였다. LMWSC의 물리화학적 특성을 조사하였으며, 동맥 벽 세포를 표적하기 위한 유전자 전달체로서 PEG-g-LMWSC의 말단에 apolipoprotein B-100에 기초하여 합성한 동맥 벽 세포에 표적 수단을 제공할 수 있는 특이성 세포 표적 펩타이드인 artery wall binging peptide (AWBP)를 컨쥬게이트 시킴으로써 AWBP-PEG-g-LMWSC을 합성하였다. FT-IR과 1H-NMR을 통해 구조적 특성을 규명하였으며 zeta-potentiometer와 atomic force microscopy (AFM)을 통해 입자 크기를 확인하였다.

실험

1) 재료

본 연구에 사용한 저분자량 수용성 키토산 (LMWSC, Mw=22kDa, DDA=84%)은 (주)키   토라이프(서울,한국)로부터 공급받았다. N-Hydroxysuccinimide polyethylene glycol       vinylsulfone (NHS-PEG-VS, Mw=3400 Da)은 Shearwater Polymers (Huntsville, AL,      USA)로부터 구입하였다. Artery wall binding peptide (AWBP) (Sequence               'N'-CGRALVDTLKFVTQAEGAK-'C', Mw=2008)은 Genemed Synthesis (South            Sanfrancisco, CA)로부터 구입했다. 투석 튜브 (molecular weight cutoff (MWCO) : 8000   , 12000)는 Spectrum (Spectrum Medical Industries, Inc., CAL, USA)으로부터 구입하였   다. 기타 시약들은 일급시약을 정제하지 않고 사용하였으며 Phosphate buffered saline    용액은 제조하여 사용하였다.

2) LMWSC의 물리화학적 분석

점도 평균 분자량 (Mw)을 측정하기 위해, 점도계 (Viscotek, Y501C, USA)를 사용하여   상대 점도를 측정하였다. Mw은 상대 점도 결과로부터 다음 Mark-Houwink-Sakurada     [6] 식(1)에 의해 계산하였다.

[□] = KMwa

Mw = ([□] / K)1/a                                              (1)

LMWSC의 탈아세틸화도 (degree of deacethylation ; DDA)는 Kina 적정법 [7]을 이용   하여 식 (2)에 의해 계산하였다.

[eqn: DDA= { (X/161)} over {(X/161)+(Y/203) } TIMES 100]                                              (2)

X = (1/400) ×(1/1000) ×f ×161 ×v

Y = 0.5 ×(1/100) + X

v : the consumption amount of 1/400 (2.5 mN) PVSK solution (ml)

f : the factor of 1/400 (2.5 mN) PVSK

구조적 특성을 규명하기 위해 FT-IR (Shimadzu, FT-IR S700), IH-NMR, 그리고          13C-NMR (Bruker, DRX-500MHz)을 사용하였다.

3) AWBP-PEG-g-LMWSC의 합성

합성 과정을 두 단계로 나뉘어진다. 첫 번째 단계에서, LMWSC 용액에 NHS-PEG-VS   용액을 첨가시켜 반응시킨 후, 증류수로 투석하여 동결 건조시켜 PEGylation LMWSC를   합성하였다. 두 번째 단계에서, Dimethyl sulfoxide에 녹인 AWBP를  PEGylation        LMWSC 용액에 서서히 첨가 반응시킨 후, 위와 같은 조건으로 투석한 후 동결 건조하   여 최종 생성물인 AWBP-PEG-g-LMWSC를 합성하였다. 생성물은 FT-IR (Shimadzu,      FT-IR S700), IH-NMR (Bruker, DRX-500MHz)로 분석하였고 사용전에는 -20℃에서 보관   하였다.

4) 입자 크기 측정

AWBP-PEG-g-LMWSC의 입자 크기를 측정하기 위해서 zeta-potentiometer (Part        370+770, Altamira instruments, USA)와 AFM (PARK's Science, Autoprobe CP)을 통해   입자 크기를 확인하였다.

결과 및 토론

1) LMWSC의 물리화학적 특성 분석

LMWSC의 고유 점도를 Huggins equation (□sp=[□]c+kH[□]2c2)19과 Kraemer equation (ln   (□/□s)=[□]c-kk[□]2c2)20 에 의해 구한 결과, LMWSC의 Mw는 약 22 kDa임을 확인하였다.    그리고 Kina 적정법에 의해 구해진 LMWSC의 DDA는 약 84%가 됨을 확인하였다.      LMWSC가 순수한 수용성 키토산임을 증명하기 위해 대조군으로서 염에 의한 수용성    키토산과 비교 분석하였다. LMWSC의 FT-IR 스펙트럼 분석 결과, 염에 의한 수용성 키   토산에서 나타나게 되는 카르복실 그룹의 흡수 피크 (1730 cm-1)가 사라지고 효소 분해   과정에 의해 형성된 불순물 피크 (2100 cm-1)가 감소함을 확인함으로써 LMWSC가 불순   물과 염이 제거된 순수한 수용성 키토산임을 확인하였다. LMWSC의 IH-NMR 스펙트럼   분석에서 염에 의한 수용성 키토산에서 나타나는 강한 불순물 피크 (1.1-1.5 ppm)가 사   라짐을 확인하였다. 13C-NMR 스펙트럼에서도 젖산염에 의한 카르복실 그룹의 피크      (20-26 ppm)가 사라졌으며 염에 의한 수용성 키토산에서는 확인할 수 없었던 아세트아   미드 그룹의 탄소의 피크 (20 ppm)를 확인할 수 있었다. 또한 수소와 탄소의 면적비에   대한 IH-NMR과 13C-NMR의 실험값이 이론값과 거의 일치하였다. 결론적으로, 본 실험   에 사용한 LMWSC은 C-2 위치의 아민 그룹에 어떠한 수용성 유도체도 도입하지 않은   순수한 수용성 키토산임을 확인하였다.

2) AWBP-PEG-g-LMWSC의 특성 및 구조 분석

Figure 1은 두 단계의 반응으로 구성된 AWBP-PEG-g-LMWSC의 합성을 나타낸 것이    다. 첫 번째 반응에서, NHS-PEG-VS의 NHS 그룹이 LMWSC의 아민 그룹에 컨쥬게이트   됨으로써 VS-PEG-g-LMWSC가 합성되었다. PEGylation LMWSC의 FT-IR과 IH-NMR 스   펙트럼 분석에서 컨쥬게이트됨으로써 이탈되는 그룹인 NHS기의 피크가 사라짐을 확인   하였다. 두 번째 반응에서, VS-PEG-g-LMWSC의 비닐 술폰 그룹 말단에 AWBP의 싸이   올기가 컨쥬게이트됨으로써 최종 생성물인 AWBP-PEG-g-LMWSC가 합성되었다. 구조적   특성은 Figure 2의 IH-NMR을 통해 분석하였다. 스펙트럼에서 AWBP의 싸이올 특성 피   크가 스펙트럼에서 전체적으로 사라졌음을 확인함으로써 AWBP의 싸이올기가           VS-PEG-g-LMWSC의 비닐 술폰 그룹에 컨쥬게이트되었음을 확인하였다.                zeta-potentiometer에 의해 측정된 AWBP-PEG-g-LMWSC의 입자 크기는 12 nm였으며    (Figure 3), 이 결과는 AFM (Figure 4)에 의해 측정된 결과와 일치함을 확인하였다. 본   연구의 결과는 앞으로 in vitro계, in vivo계에서의 연구에 있어서 유용하고 중요한 정보   를 제공할 것이다.

참고문헌

1. E. Gilboa, M.A. Eglitis, P.W. Kantoff, and F.W. Anderson, Biotechciques, 4, 504          (1986).

2. J. Smith, Y. Zhang, and R. Niven, Adv. Drug Deliver. Rev., 26, 135 (1997).

3. N.J. Caplen, E.W.F.W. Alton, P.G. Middleton, J.R. Dorin, B.J. Stevenson, X. Gao,        S.R. Durham, P.K. Jeffery, M.E. Hodson, C. Coutelle, L. Huang, D.J. Porteous, R.       Williamson, and D.M. Geddes, Nat. Med., 1, 39 (1995).

4. Lee, M., Nah, J.-W., Kwon, Y., Koh, J. I., Ko, K.S., and Kim, S.W., Pharm. Res.,         18, 427 (2001).

5. I.L. Shih, R.S. Lees, M.Y. Chang, and A.M. Lees, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 1436       (1990).

6. J.Z. Knaul, M.R. Kasaai, V.T. Bui, and A.M. Creber, Can J Chem., 76, 1699             (1998).

7. Kina, K., Tamura, K., and Ishibashi,N., Jpn Anal., 23, 1082 (1974).

Fig. 1. Synthetic scheme of AWBP-PEG-LMWSC       Fig. 2. 1H-NMR spectra of AWBP-PEG-LMWSC

Fig. 3. Particle size distribution of AWBP-PEG-LMWSC        Fig. 4. Surface morphology of an AWBP-PEG-LMWSC